Rekombinant olarak üretilecek çözünür halde glukagon reseptör proteininin glukagona olan ilgisinin araştırılması

ÖZETAmaç: Glukagon reseptörü, G-proteini ile eşleşmiş reseptörler ailesi içerisinde sınıflandırılmaktadır. Glukagon tarafından aktive olan bu reseptör kan glukoz düzeyinin belirli değerler arasında korunmasında büyük önem taşır. Vücutta normal değerlerin üzerinde sentez edilen glukagonun yol açacağı anormalliklerin tedavisinde kullanılabilecek glukagon reseptör antagonistleri üzerinde yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Bu tez çalışmasında da membrana bağlı olmayan, fakat glukagonu bağlayabilecek glukagon reseptör proteininin üretilmesi amaçlandı. Gereç ve Yöntem: İnsan glukagon reseptör geninin, sinyal peptidi kodlamayan ve sadece hücre dışı bölgesini kodlayan bölgeleri, HEPG2 hücrelerinden hazırlanan cDNA’lar üzerinden PZR ile çoğaltılarak pCAGGS ve pCHA plazmitlerine klonlandı. Benzer şekilde glukagon peptidini kodlayan cDNA Panc1 hücrelerinden RT-PZR tekniği ile çoğaltılarak, pCAGGS-GST ve pCAGGS-Flag vektörlerine klonlandı. Klonlanan cDNA’lar DNA dizi analizleri ile kontrol edildi. Rekombinant plazmitler ile transfekte edilen HEK293 hücrelerinin glukagon ve glukagon reseptör proteinlerini sentez edilip edilmediği Western melezleme tekniği ile analiz edildi. Rekombinant proteinlerin hücre içi lokalizasyonları, immünfluoresan boyama teknikleri ile saptandı. HEK293 hücrelerinde aynı anda sentez edilen GCGRΔsp ya da GCGR-ED proteinleri ile glukagon arasındaki olası etkileşim GST ile çöktürme ve birlikte immün çöktürme teknikleri ile değerlendirildi. Bulgular ve Sonuç: Elde edilen veriler, GCGRΔsp ve GCGR-ED proteinlerinin hücrelerde sitoplazmada lokalize olduğunu ortaya koydu. GST ile çöktürme deneyleri, GCGR-ED proteininin glukagon peptidinden bağımsız olarak çökeldiğini gösterdi. Birlikte immün çöktürme deneylerinde, glukagon peptidinin düşük molekül ağılıkta olmasına bağlı olarak Western melezleme deneylerinde karşılaşılan zorluklar nedeniyle istenilen sonuç alınamadı. Bu nedenle, sitoplazmik glukagon reseptör proteinleri ile glukagon arasındaki olası fiziksel etkileşimi ortaya koymaya yönelik çalışmalar sürdürülmektedir.Anahtar Kelimeler: Glukagon Reseptörü, Glukagon, Diyabet, AntagonisSUMMARYAim: Glucagon receptor is classified within the G-protein coupled receptors family. The receptor activated by glucagon has a vital importance for maintaining of blood glucose level in the normal values. There are extensive studies on glucagon receptor antagonists that can be used for treatment of abnormalities caused by the hyperglucagonemia. In this study, it was aimed to produce the non-membranous glucagon receptor proteins that capable of binding to glucagon.Material and Methods: Human glucagon receptor gene cDNA without leader sequence and a part of gene encoding extracellular domain of receptor protein were prepared from HEPG2 cells with RT–PCR and cloned into pCAGGS and pCHA plasmids. Similarly, the cDNA encoding glucagon peptide was amplified with RT-PCR from Panc1 cells, and cloned into pCAGGS-GST and pCAGGS-Flag vectors. Cloned cDNAs were verified by DNA sequencing. The synthesis of glucagon and glucagon receptor protein in HEK293 cells transfected with plasmids were analyzed by Western blotting. Intracellular localization of recombinant proteins were detected by immunofluorescent techniques. The possible interactions between glucagon and GCGRΔsp or GCGR-ED proteins were evaluated by co-immunoprecipitation and GST pull down assay.Results and Discussion: The results showed that GCGRΔsp and GCGR-ED are localized in cytoplasm of the cells. GCGR-ED was independently precipitated from glucagon with GST pull down assay. It could not get the desired results with co-immunoprecipitation experiments because of the low molecular weight of glucagon and stringency faced in Western blotting. Therefore, the studies to reveal possible interaction between cytoplasmic glucagon receptor proteins and glucagon is going on.Keywords: Glucagon Receptor, Glucagon, Diabetes, Glucagon Antagonis