Identification and characterisation of chitin and cellulose synthases in oomycetes : New tools for biochemical studies and structure determination

Despite resembling ‘true’ fungi in terms of morphological features, oo­mycetes form a distinct eukaryotic lineage of filamentous microorganisms that belongs to the stramenopiles, a group of protists also comprising the closely-related brown algae and diatoms. Many oomycetes are devastating pathogens of plants and animals, globally causing significant economic los­ses in the agriculture and aquaculture industries, and posing considerable environmental damage to natural ecosystems. Although the cell wall (CW) is critical for the viability and morphogenesis of the organism it surrounds, our knowledge of oomycete CW architecture and biosynthetic enzymes is limited. Given the vast threat that pathogenic oomycetes pose, uncovering the details of CW biosynthesis and regulation in these pathogens may re­veal new opportunities for disease control. To this end, we aimed to elucidate the role of putative membrane-bound glycosyltransferase family 2 enzymes implicated in the biosynthesis of oo­mycete CW polysaccharides. Suitable gene candidates were identified, and their products analysed, as illustrated by the oomycete-wide discovery and phylogenetic analysis of the chitin synthase gene family (paper I), and the identification of the cellulose synthase genes in Saprolegnia parasitica (paper II) and Phytophthora capsici (paper III). Expression of promi­sing candidate genes was verified using different techniques, including gene expression analysis (papers II and III), and the effect of inhibitors on hyphal growth (papers I and II) and enzymatic activity in in vitro assays (paper II). Single enzymes representing putative chitin synthases from various organisms (unpublished data) and cellulose synthases from S. parasitica (extended data for paper II), and P. capsici cellulose syn­thase 1 (paper III) were produced, and partly enriched or even purified, in yeast strains specifically engineered to facilitate the biochemical characterisation of the recombinant proteins in in vitro enzyme assays. To advance functional investigations and structure determination of integral membrane proteins, we developed DirectMX, a method that allows the re­constitution of target proteins with their surrounding lipids directly from crude cell membranes into Salipro nanoparticles (paper IV).Trots sina morfologiska likheter med ”äkta” svampar, tillhör oomyceterna en separat eukaryotisk utvecklingslinje av filamentösa mikroorganismer som ingår i gruppen stramenopiler. Stramenopiler beskriver ett fylum av protister som även omfattar de nära besläktade brun- och kiselalgerna. Många oomyceter infekterar växter och djur med förödande konsekvenser och stora ekonomiska förluster för land- och vattenbruk globalt. Infek­tionerna orsakade av oomyceter resulterar även i stora miljöskador på naturliga ekosystem. Trots att cellväggen påverkar organismens viabilitet och morfogenes, är vår kunskap av oomyceternas cellväggsarkitektur och biosyntetiska enzymer begränsad. Med tanke på det hot som patogena oomyceter utgör, kan avsjöjanden av detajlerna kring cellväggens bio­syntes och reglering i dessa patogener medföra förbättrade möjligheter för smittskyddet. Därför ville vi klarlägga rollen av förmodade, membranbundna glyco­syltransferas familj 2-enzymer, som antas vara inblandade i biosyntesen av oomyceternas cellväggspolysackarider. Lämpliga genkandidater identi­fierades och deras genprodukter analyserades, vilket illustreras av den fylogenetiska analysen av kitinsyntas-genfamiljen (artikel I), och identi­fiering av cellulosasyntasgener i Saprolegnia parasitica (artikel II) och Phytophthora capsici (artikel III). Uttryck av lovande kandidatgener verifierades med hjälp av olika tekniker, bland andra genuttrycksanalys (artikel II och III), påverkan av inhibitorer på hyfernas tillväxt (artikel I och II) och enzymaktivitet i in vitro analyser (artikel II). Enskilda, för­modade kitinsyntaser från olika organismer (opublicerade data) och cellu­losasyntaser från S. parasitica (utökad data för artikel II), samt P. capsici cellulosasyntas 1 (artikel III), producerades, delvis i anrikad och även renad form, i speciellt framtagna jäststammar som tillåter en biokemisk karakterisering av de rekombinanta proteinerna i in vitro enzymanalyser. För att främja funktionsstudier och strukturbestämningar av integrala membranproteiner utvecklade vi DirectMX (artikel IV). DirectMX är en metod som möjliggör rekonstitution av målproteiner tillsammans med omgivande lipider från orenade cellmembraner i Salipro nanopartiklar.QC 2021-10-22