Identification of Nontuberculous mycobacteria proteins involved in cellular aggregation and biofilm formation

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaO género Mycobacterium possui 208 espécies, a maioria ubíquas do ambiente, designadas de micobactérias não tuberculosas (MNT), que podem ser potenciais patogénios oportunistas. O género inclui ainda patogénios intracelulares obrigatórios como o Complexo Mycobacterium tuberculosis e a espécie Mycobacterium leprae. As MNT têm capacidade de proliferação em ambientes naturais (solos e águas) ou ambientes artificiais, como hospitais e sistemas de distribuição de água da rede pública. A sua resiliência inata está intrinsecamente associada às suas características fisiológicas, uma vez que a sua parede celular, formada pelo complexo micolil-arabinogalactano-peptidoglicano, origina células altamente hidrofóbicas com elevada impermeabilidade. As MNT possuem também capacidade de formar agregados celulares e biofilmes, que repelem o efeito de desinfetantes e antimicrobianos, devido à sua elevada hidrofobicidade. A disponibilidade de nutrientes, poderá ter influência direta na morfologia, induzir a expressão de proteínas e por isso contribuir para a sua resistência a antibióticos e patogenicidade. Foram escolhidas duas espécies M. smegmatis e Mycobacterium hassiacum, para avaliar a influência de diferentes meios na sua morfologia, agregação celular e expressão de proteínas totais. Testou-se a adição de ZnSO4, concentração de fonte de carbono e fonte de azoto alternativa, utilizando como base o meio Sauton e feita a comparação com o meio comumente utilizado, o Middlebrook 7H9 suplementado com OADC. A formação de biofilme foi registada nos diferentes meios, revelando alterações morfológicas a nível macro e microscópio, e, foram identificadas proteínas hipotéticas que foram investigadas quanto à possibilidade de serem potenciais alvos terapêuticos. A suscetibilidade a antibióticos foi avaliada nas diferentes condições, para perceber o impacto das condições de crescimento no fitness das células e fazer uma ligação entre ambos.Adicionalmente, foram realizados testes bioquímicos e de suscetibilidade para uma nova espécie de micobactéria isolada de fonte ambiental, dada a importância científica e de saúde pública de novas espécies potencialmente patogénicasThe genus Mycobacterium includes 208 species, many of which are ubiquitous environmental species designated nontuberculous mycobacteria (NMT), with the potential for being opportunistic pathogens. The genus also includes known obligate intracellular pathogens, such as members of the Mycobacterium tuberculosis Complex and Mycobacterium leprae.NMT have the capacity to proliferate in natural environments (soils and waters), or artificial environments, such as hospitals and public water distribution systems. Their innate resilience is intrinsically associated with physiological characteristics, since the cell wall is formed by the mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan complex that originates highly hydrophobic cells with low permeability. They also possess ability to form cell aggregates and biofilms, which repel the effect of disinfectants and antimicrobials, due to their hydrophobicity. Nutrient’s availability, may also have direct influence on their morphology, induce different proteins expression and therefore contribute to their resistance to antibiotics and pathogenicity. Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium hassiacum were selected to evaluate the influence of different media on phenomena of biofilm formation and cell aggregation, morphology, and proteins expression. The concentration of the carbon source, addition of ZnSO4 and nitrogen source were tested, based on Sauton Medium composition and using medium Middlebrook 7H9 with OADC (commonly used for mycobacteria growth) for comparative purposes. Biofilm formation was registered in different media, revealing morphological changes at macro and microscopic levels, hypothetical proteins were identified and investigated as possible therapeutic targets. The susceptibility to antibiotics was evaluated under different conditions to understand the impact of growth conditions on cells fitness as well as to understand the link between both. Additionally, biochemical and susceptibility tests were carried out for a new mycobacterium species isolated from the environment, given the scientific and public health significance of characterization of new potentially pathogenic species