Layer-by-Layer Encapsulation Study of Probiotic Lactic Acid Bacteria

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Química apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaO objetivo deste trabalho consistiu em desenvolver um sistema para encapsular bactérias de ácido láctico, em particular a estirpe Lactobacillus plantarum WCFS1, com a adição de um componente com propriedades prebióticas, um fruto-oligossacarídeos (FOS). Pretende-se que este sistema permita a proteção dos probióticos, durante o processo de produção (nomeadamente o processo de liofilização), armazenamento, e ainda, contra as condições ácidas do estômago, proporcionando uma libertação controlada destes no intestino, a pH básico. O método adotado para a encapsulação das bactérias probióticas foi o método de deposição Layer-by-Layer (LbL), que é promovido pela atração eletrostática entre o substrato (superfície das bactérias), carregado negativa ou positivamente, e polieletrólitos de cargas opostas. Foram estudados dois revestimentos, cada um com duas camadas: um formado por polímeros naturais, o quitosano (CHI), com carga positiva, e o alginato de sódio (ALG), com carga negativa, e outro formado também por CHI e um copolímero sintético, o poli(ácido acrílico)-Pluronic®-poli(ácido acrílico) (PPP), de caracter aniónico. As bactérias não encapsuladas e encapsuladas foram caracterizadas através da medida do potencial-ζ, determinação da viabilidade bacteriana antes e após os processos de encapsulação, liofilização, armazenamento e exposição aos meios gastrointestinais simulados, e registo das curvas de crescimento antes e depois da encapsulação e liofilização. De um modo geral, quando comparadas as bactérias antes e depois de encapsuladas, pode concluir-se que a encapsulação com duas camadas, obteve resultados de menor perda de viabilidade, sugerindo ser um sistema mais promissor na proteção dos probióticos. O complexo biopolímero natural-copolímero sintético (CHI-PPP) revelou melhores resultados em relação ao complexo de biopolímeros naturais (CHI-ALG), nomeadamente, na resistência às condições gastrointestinais simuladas e no menor tempo de latência de crescimento bacteriano. No entanto, as bactérias não encapsuladas apresentaram valores de viabilidade superiores às bactérias encapsuladas, o que pode ser explicado pelo facto desta estirpe bacteriana ser bastante resistente. Por último, ao longo do armazenamento, o efeito do FOS não demonstrou melhoria da perda de viabilidade. Em resumo, os resultados para esta estirpe em particular, permitem concluir que o processo de encapsulação parece não ser o mais adequado, contudo, a aplicação deste método é bastante promissora para a proteção de estirpes bacterianas mais sensíveis.The aim of this work was the development of an intelligent system to encapsulate lactic acid bacteria, in particular the strain Lactobacillus plantarum WCFS1, with the addition of a food component with prebiotic properties, such as fructooligosaccharides (FOS). This system allows the probiotics to be protected during the production process (namely in the lyophilization), storage, and against the stomach acidic conditions, providing a controlled release of the probiotics in the intestine, at basic pH.The method adopted for the encapsulation of probiotic bacteria was the Layer-by-Layer (LbL) deposition method, which is promoted by the electrostatic attraction between the substrate (surface of the bacteria), negatively or positively charged, and polyelectrolytes of opposite charges. Two coatings were studied, each with two layers: one formed by natural polymers, chitosan (CHI), with positive charge, and sodium alginate (ALG), with negative charge, and another formed also by CHI and a synthetic copolymer, Poly(acrylic acid)-Pluronic®-Poly(acrylic acid) (PPP), of anionic character. The unencapsulated and encapsulated bacteria were characterized by measuring the potential-ζ, determining bacterial viability before and after encapsulation, freeze-drying, storage, and exposure to simulated gastrointestinal media, and recording growth curves before and after encapsulation and freeze-drying.Overall, when comparing the bacteria before and after encapsulation, it can be concluded that encapsulation with two layers, obtained results of less loss of viability, suggesting it is a more promising system in the protection of probiotics. The natural biopolymer-synthetic biopolymer complex (CHI-PPP) showed better results compared to the natural biopolymer complex (CHI-ALG), namely in resistance to simulated gastrointestinal conditions and shorter latency time of bacterial growth. However, the non-encapsulated bacteria showed higher viability values than the encapsulated bacteria, which can be explained by the fact that this bacterial strain is quite resistant. Finally, throughout storage, the effect of FOS did not improve the viability loss.In summary, the results for this strain, allow us to conclude that the encapsulation process seems not to be the most appropriate, however, the application of this method is very promising for the protection of more sensitive bacterial strains.Outro - FCT: através do financiamento plurianual POCI-01-0145-FEDER-006910 do Centro de Investigação em Engenharia dos Processos Químicos e dos Produtos da Floresta (CIEPQPF) e Comissão Europeia: através do financiamento do projeto PREMIUM (MSCA-RISE-2017) Grant Agreement nº 77765