Liquid Biopsies and Molecular Characterization of Oral Cancer

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaO cancro oral é uma das formas mais comuns do cancro da cabeça e pescoço, sendo um dos mais predominantes a nível global. Apesar dos avanços no tratamento, devido ao diagnóstico tardio, a taxa de mortalidade permanece elevada. A identificação de biomarcadores moleculares é importante para auxiliar no diagnóstico, prognóstico e tratamento. Uma possível abordagem para a identificação de biomarcadores são as biópsias líquidas. Estas além de serem menos invasivas e mais acessível do que as biópsias de tecido, contêm o DNA livre de origem tumoral que reflete com maior precisão a heterogeneidade genética do tumor. O presente estudo tem como objetivo a caraterização molecular do cancro oral, através de análise das biópsias de tecido e biópsias líquidas. Neste estudo monitorizaram-se os níveis de DNA livre nas biópsias líquidas, plasma e urina, de 22 doentes com cancro oral. Os resultados preliminares demonstraram no plasma níveis médios de DNA mais elevados nos doentes em relação aos controlos. Em alguns dos doentes que desenvolveram metástases/recidiva ao longo do acompanhamento clínico, verificou-se um aumento dos níveis de DNA livre no plasma e/ou na urina. Procedeu-se também a uma tentativa de otimizar a extração de DNA livre a partir da urina, utilizando para tal dois métodos distintos. A análise de todo o genoma tumoral, através da técnica array-Comparative genomic hybridization (aCGH), demonstrou que os cromossomas 3q, 4p, 5q, 6q, 7p, 7q, 8p, 14q,15q e Xp eram os mais frequentemente alterados. Além disso, verificou-se que a maioria das alterações concomitantes estavam localizadas no cromossoma 8q. O perfil genético e epigenético do tecido tumoral e não tumoral foi analisado através da técnica Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MS-MLPA). No tecido tumoral, as alterações mais frequentes foram a perda nos genes CDKN2A e VHL, ganho em PTCH1 e MLH3, e metilação dos genes WT1, GATA5, RARB, PAX5 e PAX6. Alteração nos genes VHL e STK11, ganho no MLH3 e metilação de WT1, GATA5, CADM1 e CHFR parecem estar associados ao pior prognóstico. Em contrapartida, ganho no gene PTCH1 e metilação do gene PAX5 parecem estar associados ao melhor prognóstico. No tecido não tumoral, mais alterações foram detetadas nas amostras com as margens cirúrgicas negativas. Estes resultados preliminares precisam ser validados com mais estudos, em coortes maiores e também com um tempo de acompanhamento clínico mais extenso, para deste modo estabelecer uma forte correlação genótipo-fenótipo, e identificar os possíveis biomarcadores de diagnóstico, prognóstico e tratamento.Oral cancer is a complex disease and one of the most common forms of head and neck cancer, being one of the most prevalent globally. Despite advances in treatment, due to late diagnosis, the mortality rate remains high. The identification of molecular biomarkers is important to aid in diagnosis, prognosis and treatment. A possible approach for identifying biomarkers is liquid biopsies. These, in addition to being less invasive and more accessible than tissue biopsies, contain cell-free DNA of tumor origin that reflects more accurately the tumor genetic heterogeneity. The present study aims at the molecular characterization of oral cancer, through the analysis of tissue biopsies and liquid biopsies.In this study, total cell-free DNA levels in liquid biopsies, plasma and urine, of 22 patients with oral cancer were monitored. Preliminary results showed, on average, higher levels of plasma cell-free DNA in patients compared to controls. In some of the patients who developed metastases/recurrence during clinical follow-up, there was an increase in cell-free DNA levels in plasma and/or urine. An attempt was made to optimize the extraction of urine cell-free DNA, using two different methods for this purpose. The analysis of the entire tumor genome, using the array-Comparative genomic hybridization (aCGH) technique, showed that chromosomes 3q, 4p, 5q, 6q, 7p, 7q, 8p, 14q,15q and Xp were the most frequently altered. Furthermore, most of the concomitant alterations were found to be located on chromosome 8q. The genetic and epigenetic profile of tumoral and non-tumor tissue was analysed using the Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MS-MLPA) technique. In tumor tissue, the most frequent alterations were loss of genes CDKN2A and VHL, gain in PTCH1 and MLH3, and methylation of genes WT1, GATA5, RARB, PAX5 and PAX6. Alterations in VHL and STK11 genes, gain in MLH3 and methylation of WT1, GATA5, CADM1 and CHFR seem to be associated with a worse prognosis. On the other hand, gain in the PTCH1 gene and methylation of the PAX5 gene seem to be associated with a better prognosis. In non-tumor tissue, more changes were detected in samples with negative surgical margins.These preliminary results need to be validated with further studies, in larger cohorts and a longer clinical follow-up time, to establish a solid genotype-phenotype correlation, and to identify potencial diagnostic, prognostic and treatment biomarkers