Immunological effects of photodynamic therapy

Tese no âmbito do doutoramento em Química, ramo de Química Médica, apresentada ao Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Photodynamic therapy (PDT) relies on the administration of a photosensitizer (PS) that is activated on the target tissue after the irradiation with light of a specific wavelength absorbed by the PS. Redaporfin is a recently developed photosensitizer for PDT that is currently in phase 2 clinical trials (NCT02070432). Redaporfin is a photostable bacteriochlorin with intense infrared absorption, high yield of ROS generation, high phototoxicity, low skin photosensitivity and favorable pharmacokinetics. A vascular protocol of redaporfin-PDT with mice bearing CT26.WT tumors not only destroys the primary tumor but also reduces the development of metastasis, thus suggesting antitumor immunity. This work characterizes the immune response triggered by this vascular-PDT protocol. At different timepoints after tumor irradiation, blood samples were collected, and distinct immune cell populations and cytokines were quantified. Redaporfin-PDT leads to a strong neutrophilia, with systemic increase of IL-6, increased percentage of CD4+ and CD8+ T cells producing IFN-γ or CD69+ and increased CD4+/CD8+ T cell ratio. We also showed that at the tumor bed, T cell tumor infiltration disappeared after PDT but reappeared with a much higher incidence one day later. The depletion of specific immune populations suggested that neutrophils and cytotoxic T cells have a major role in the development of the antitumor immune response elicited by redaporfin-PDT, while helper T cells may just have a supportive role. Regarding this, we hypothesize that the combination of redaporfin-PDT with an immune therapy may potentiate the efficacy of both therapies, namely by increasing the response rates of immunotherapies and strengthening the systemic effects of PDT, especially in difficult tumors to treat. The tumor models were selected taking in consideration that redaporfin-PDT is capable of eliciting immunogenic cell death (ICD) and may be able to enhance the immunogenicity of tumor cells. Melanoma and mammary carcinoma tumors are recognized to be more aggressive and difficult to treat than most mouse tumor models, namely colon carcinoma. The response to redaporfin-PDT was evaluated in mouse mammary carcinoma expressing luciferase (4T1-luc2) and in mouse skin melanoma (B16F10) tumor models, and PDT parameters were optimized to maximize the impact on tumors while minimizing treatment lethality. A significant edema that later progressed to necrosis was observed in both tumor models. However, cures were only achieved with the B16F10 tumor model. Imaging with photoacoustic tomography suggested that the lower content of redaporfin in 4T1 tumors is the main reason for the challenging behavior of this orthotopic 4T1 model. The antitumor effect elicited by PDT is in some cases opposed by the immunosuppressive mechanisms elicited by tumor cells which makes the treatment ineffective. Thus, immunotherapies that have as major goal the alleviation of this immunosuppressive tumor environment are interesting for combination therapies, increasing the efficacy with better antitumoral and antimetastatic effects. We reported a combination of redaporfin-PDT with immunotherapies using CTLA-4 and PD-1 in three different tumor models. Treatment outcomes were evaluated by survival, tumor growth kinetics and, for the carcinoma model, observation of metastasis development by bioluminescent imaging. Furthermore, we evaluated the changes on expression of several immune checkpoint molecules triggered by redaporfin-PDT in vitro. Combination of redaporfin-PDT with CTLA-4 immunotherapy, but not with PD-1, led to a significant improvement of survival and a higher cure rate in the colon carcinoma animal model. However, the same was not achieved with the melanoma and breast carcinoma animal models. Expression of immune checkpoint molecules was induced in tumor cells treated in vitro with redaporfin-PDT. The most notable changes were observed for CD80 and PD-L1. These results demonstrate that the combination of photodynamic therapy with immunotherapy may improve the treatment of malignant diseases that represent a challenge to immunotherapies alone and highlights the fact that a global therapeutic strategy may not be ideal for every tumor model. Combinatorial approaches are not universal and have to be tailored to the specificities of each clinical case.A terapia fotodinâmica (PDT, do inglês, photodynamic therapy) consiste na administração de um fotossensibilizador (PS, do inglês, photosensitizer) que é ativado no tecido alvo após a irradiação com luz com um comprimento de onda absorvido pelo PS. A redaporfin é um fotossensibilizador desenvolvido recentemente para a PDT e que está atualmente em ensaios clínicos fase 2 (NCT02070432). A redaporfin é uma bacterioclorina fotoestável com intensa absorção no infravermelho próximo, elevado rendimento de formação de espécies reativas de oxigénio (ROS, do inglês, reactive oxygen species), elevada fototoxicidade, baixa fotossensibilidade da pele e uma farmacocinética favorável. A aplicação de um protocolo de PDT vascular com redaporfin em murganhos com tumores de carcinoma do cólon (CT26.WT) não só destrói o tumor primário como também reduz o desenvolvimento de metástases, sugerindo assim o aparecimento de imunidade anti-tumoral. Este trabalho caracteriza a resposta imunitária desencadeada através deste protocolo de PDT vascular. Em tempos pré-determinados após a irradiação do tumor foram feitas colheitas de sangue e foram quantificadas as diferentes populações de células imunes e citocinas envolvidas na resposta imunitária. A PDT com a redaporfin provoca uma forte neutrófilia, um aumento sistémico da IL-6, um aumento da percentagem de células CD4+ e CD8+ T que produtoras de IFN-γ ou CD69+ e um aumento do rácio de células T CD4+/CD8+. Ao nível do leito tumoral, a infiltração de linfócitos T desaparece após a PDT, mas reaparece com muito maior incidência 24 h mais tarde. A depleção de populações de células imunes específicas demonstrou que os neutrófilos e as células T citotóxicas desempenham um papel importante no desenvolvimento da resposta imune anti-tumoral desencadeada pela PDT com redaporfin, enquanto que as células T auxiliares parecem desempenhar apenas um papel de suporte. Tendo isto em consideração, propomos que a combinação da PDT com a redaporfin e a imunoterapia pode potenciar a eficácia de ambos os tratamentos, nomeadamente através do aumento da taxa de resposta às imunoterapias bem como o reforço do efeito sistémico da PDT, especialmente em tumores difíceis de tratar. Os modelos tumorais utilizados nestes estudos foram selecionados tendo em conta que a PDT com a redaporfin é capaz de gerar morte celular imunogénica e aumentar a imunogenicidade das células tumorais tratadas. Os melanomas e carcinomas mamários são reconhecidos por serem bastante mais agressivos e difíceis de tratar do que a maioria dos modelos tumorais de murganho usados, como o carcinoma do cólon. A resposta à PDT com redaporfin foi avaliada em murganhos com modelos tumorais de carcinoma mamário que expressa luciferase (4T1-luc2) e de melanoma da pele (B16F10). Os parâmetros da PDT foram otimizados para maximizar o impacto no tumor primário e minimizar a letalidade do tratamento. Em ambos os modelos foi observado edema que posteriormente evoluiu para necrose, contudo, apenas foram obtidas curas no modelo de melanoma. Recorrendo a tomografia fotoacústica verificou-se que o baixo conteúdo de redaporfin que consegue aceder ao tumor pode ser a principal razão para a falta de eficácia no modelo ortotópico de 4T1. A resposta anti-tumoral desencadeada pela PDT é por vezes neutralizada por mecanismos imunossupressores desencadeados pelas células tumorais que diminuem a eficácia do tratamento. Deste modo, as imunoterapias que têm como função atenuar o ambiente tumoral imunossupressor aparentam ser promissoras em terapias combinatórias que ambicionam aumentar a eficácia dos efeitos anti-tumorais e anti-metastáticos. Neste estudo, reportamos a combinação da PDT com redaporfin e as imunoterapias usando a CTLA-4 e a PD-1 em três modelos tumorais diferentes. Os resultados dos tratamentos foram avaliados através do tempo de sobrevida, da cinética de crescimento tumoral e, para o caso do modelo do carcinoma mamário, do desenvolvimento das metástases analisado através de imagiologia de bioluminescência. Posteriormente, as alterações da expressão de diferentes moléculas dos checkpoints imunitários em células tumorais foram avaliadas após a PDT in vitro. A combinação da PDT com a redaporfin e a imunoterapia com CTLA-4, mas não com a PD-1, originou uma melhoria significativa da sobrevida e um aumento da taxa de curas no modelo de carcinoma do cólon de murganhos. Contudo, o mesmo não se verificou para os modelos de melanoma e de carcinoma mamário. O aumento da expressão de moléculas dos checkpoints imunitários foi induzido de forma significativa nas células tumorais após o tratamento de PDT in vitro. As alterações mais notáveis foram observadas para CD80 e PD-L1. Os resultados sugerem que a combinação de PDT com imunoterapia pode ser eficaz no tratamento de tumores que são um maior desafio para a imunoterapia como tratamento isolado. Isto salienta a ideia de que uma estratégia terapêutica global pode não ser a ideal para todos os modelos tumorais. As estratégias combinatórias não são universais e necessitam de ser adaptadas às especificações de cada caso clínico.Luzitin S.A