Mechanomodulation of the mesenchymal stem cell proteome elucidation of mechanisms and evaluation as a therapeutic opportunity

Tese no âmbito do Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, na área de especialização em Biotecnologia e Saúde, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra.Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) are a heterogeneous population of multipotent stromal cells that can be isolated from various tissues such as bone marrow, adipose tissue and umbilical cord. In the last years, MSCs have been considered as promising for clinical applications in a variety of diseases due to their unique biological properties. However, the number of MSCs required for therapeutic purposes involves extensive in vitro expansion. Currently, the in vitro expansion of MSCs is performed in standard cell culture conditions, including tissue culture polystyrene (TCPS) as substrate, which is significantly stiffer (GPa range) than the natural cellular microenvironment (kPa range). To alter this paradigm, a number of substrates that mimic distinct aspects of the extracellular matrix (ECM) were developed for cell culture, providing cell adhesion and more physiological mechanical support. The mechanical properties of the ECM or substrate (for in vitro cell culture) are interrogated by cells and integrated through mechanotransduction. MSCs are mechanosensitive cells and it is known that substate stiffness or other mechanical cues from the microenvironment can influence their proliferation, differentiation and gene expression. Until now, the effect of substrate stiffness in MSC’s proteomic profile is still unclear. Concomitantly, and bearing in mind that MSCs’ standard cell culture conditions lead to the loss of cell potency, with impact on their therapeutic effectiveness, this work proposed to explore the influence of substrate stiffness in the proteome of proliferating undifferentiated human umbilical cord matrix (hUCM)-MSCs. A quantitative and comprehensive characterisation of the MSC proteome (encompassing intracellular & membrane-associated proteins and secretome) was performed for hUCM-MSCs cultured on stiff TCPS and soft polydimethylsiloxane (PDMS) substrates. The relative abundance of several proteins changed significantly by expanding cells during 3 passages (P1-P4) on stiff (GPa) or soft (~3 kPa) substrates. Many of the proteins identified in the intracellular & membrane-associates fractions are associated with the regulation of the actin cytoskeleton, a major player in mechanotransduction mechanisms. As a consequence of such findings, the protein Cofilin-1 was identified and characterised as a new mechanosensitive regulator of transcription. Cofilin-1 levels were elevated in cells cultured on soft substrates when compared with stiff. Also, on the soft PDMS substrate, Cofilin-1 was dephosphorylated/active and predominantly present in the cells’ nuclei, in contrast with its phosphorylated/inactive and cytosolic distribution in cells on a stiff environment. Cofilin-1 showed to facilitate transcription, through a mechanism that seems to involve the enhancement of RNA polymerase II transcription elongation. Additionally, a set of proteins with antioxidant activity were found to be more abundant in the secretome of cells cultured on the soft PDMS substrate than on the stiff TCPS surface. The secretome obtained from hUCM-MSCs cultured on the soft substrate revealed to possess enhanced capacity to rescue dopaminergic N27 neuronal cells from oxidative stress and apoptosis (caused by incubation with 6-hydroxydopamine) in comparison with that collected from MSCs expanded on stiff TCPS. In summary, this work resulted in the identification of specific proteins whose levels were significantly modulated by substrate stiffness, addressing some of the mechanisms involved in their mechanomodulation, as well as the biological consequences of such changes. The data presented here will contribute to advances of the development of new and alternative cell culture conditions for the expansion of MSCs, with an expected future impact on the therapeutic effectiveness and clinical value of MSC- and secretome-based therapies. RESUMOAs células estaminais/estromais mesenquimais (MSCs) são uma população heterogénea de células estromais multipotentes que pode ser isolada a partir de vários tecidos, tais como medula óssea, tecido adiposo e cordão umbilical. Nos últimos anos, as MSCs têm sido consideradas como promissoras para aplicações clínicas numa variedade de doenças, devido às suas propriedades biológicas únicas. No entanto, o número de MSCs necessário para o propósito terapêutico envolve uma extensiva expansão in vitro. Atualmente, a expansão in vitrode MSCs é feita em condições de cultura celular padrão, incluindo o poliestireno (PS) para a cultura de tecidos como substrato, que é significativamente mais rígido (na ordem dos GPa) do que o seu microambiente celular natural (na ordem dos kPa). Para alterar este paradigma, um conjunto de substratos que mimetizam distintos aspetos da matriz extracelular (MEC) foram desenvolvidos para a cultura de células, promovendo adesão celular e suporte mecânico mais fisiológico. As propriedades mecânicas da MEC ou substrato (no caso da cultura celular in vitro) são sentidas pelas células e integradas através da mecanotransdução. As MSCs são células mecanosensíveis sabe-se que a rigidez do substrato ou outros estímulos mecânicos provenientes do microambiente influenciam a sua proliferação, diferenciação e expressão genética. Até agora, não é claro qual o efeito que diferentes graus de rigidez do substrato têm no perfil proteómico das MSCs.Assim, e tendo em conta que as condições de cultura celular padrão das MSCs levam à perda de potencia celular, com impacto na sua eficácia terapêutica, este trabalho propôs explorar a influência da rigidez do substrato no proteoma de MSCs da matriz do cordão umbilical (MCU) indiferenciadas e em proliferação. Para atingir esse objetivo, foi realizada uma caracterização quantitativa e exaustiva do proteoma (incluindo proteínas intracelulares & associadas a membrana, e também o secretoma) de MSCs da MCU cultivadas em substratos rígidos de PS e menos rígidos de polidimetilsiloxano (PDMS).A abundância relativa de várias proteínas alterou-se significativamente ao expandir as células durante 3 passagens (P2-P4) em substratos rígidos (GPa) ou menos rígidos (~3 kPa). Muitas das proteínas identificadas nas frações intracelular e associada à membrana estão relacionadas com a regulação do citoesqueleto de actina, um dos principais elementos envolvido em mecanismos de mecanotransdução. Como consequência destas descobertas, a proteína Cofilina-1 foi identificada e caracterizada como sendo um novo regulador mecanosensível da transcrição. Os níveis de Cofilina-1 eram mais elevados em células cultivadas em substratos menos rígidos quando comparados com os mais rígidos. Adicionalmente, em substratos menos rígidos de PDMS a Cofilina-1 apresentou-se desfosforilada/ativa e localizada predominantemente no núcleo, em contraste com a sua forma fosforilada/inativa e distribuição citoplasmática verificada em células cultivas em substratos rígidos. A Cofilina-1 demonstrou facilitar o processo de transcrição através de um mecanismo que parece envolver o aumento da elongação transcricional por RNA polimerase II. Adicionalmente, um conjunto de proteínas com atividade antioxidante foi identificado como sendo mais abundante no secretoma de células cultivadas no substrato menos rígido (PDMS) do que no mais rígido (TCPS). O secretoma obtido a partir de MSCs da MCU cultivadas no substrato menos rígido demonstrou ter uma capacidade acrescida para recuperar células neuronais dopaminérgicas N27 de stress oxidativo e apoptose (causados por exposição a 6- Resumoivhidroxidopamina) em comparação com o secretoma recolhido de MSCs expandidas em TCPS rígido.Resumidamente, este trabalho resultou na identificação de proteínas especificas cujos níveis foram significativamente modulados pela rigidez do substrato de cultura de células, abordando alguns dos mecanismos envolvidos na sua mecanomodulação assim como nas consequências biológicas dessas alterações. Desta forma, estes dados podem contribuir para o desenvolvimentode condições de cultura novas e alternativas para a expansão de MSCs, com um impacto esperado na sua eficácia terapêutica e valor clínico de terapias baseadas em MSCs e nos seus secretomas.Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), através do COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade e Internacionalização, e fundos nacionais Portugueses via FCT, I.P, com os projetos: POCI-01-0145-FEDER-029516 (referência: PTDC/MED-NEU/29516/2017); POCI-01-0145-FEDER-029311 (referência: PTDC/BTM-TEC/29311/2017); POCI-01-0145-FEDER-016428 (referência: SAICTPAC/0010/2015); UID/NEU/04539/2019 (CNC.IBILI plano estratégico) e UIDB/04539/2020 (CIBB plano estratégico)