Atom transfer radical polymerization: study of ligands and preparation of block copolymers with controlled structures for application in high-performance coatings

Tese no âmbito do doutoramento em Engenharia Química, apresentada ao Departamento de Engenharia Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Abstract This work aimed to develop a new antimicrobial system using supplemental activator and reducing agent atom transfer radical polymerization (SARA ATRP) with potential to be applied in coating formulations and to prepare innovative antimicrobial surfaces. It was also a goal to study a new ligand for metal-catalyzed ATRP as a cost-effective alternative for other ligands commonly used in ATRP. ATRP, at the scientific level, is one of the most used reversible deactivation radical polymerization (RDRP) processes for the preparation of complex and well-defined polymeric structures. However, one of the issues related to the scale-up of such technique to an industrial scenario is the high cost of the N-based ligands, which are indispensable to conduct the polymerizations. Thus, the development of new ATRP systems using economically affordable ligands is a key-step that can contribute to the feasible preparation of controlled polymers at large scale. In this project, for the first time, N,N,N’,N’-tetramethyl guanidine (TMG), an inexpensive compound, was successfully used as ligand for the SARA ATRP of several methacrylates, namely methyl methacrylate (MMA), glycidyl methacrylate (GMA), ethyl methacrylate (EMA), butyl methacrylate (BMA) and 2-(diisopropylamino)ethyl methacrylate (DPA). Reproducible kinetics could be only obtained after careful adaptation of the setup and degassing procedures to avoid interaction between initiator and TMG. After the optimization of the synthetic procedure, the control over the polymerizations was similar to that obtained using other ligands often employed in ATRP (Mw/Mn ≈ 1.2). The influence of DP and initiator/TMG ratio on the polymerization was investigated and showed that the rate of polymerization decreased with increasing DP. Also, cyclic voltammetry studies were conducted to prove the formation and stability of CuI/TMG complexes. The high chain-end functionality of PMMA-Br was proved by self-chain extension and block copolymerization with BMA, with a remarkable agreement between Mnth and MnSEC and low dispersity (Mw/Mn < 1.2). In addition, experiments conducted in the absence of Cu0 (SARA agent) showed that TMG can act simultaneously as the ligand for the metal coordination and as reducing agent, affording well-defined PMMA-Br (Mw/Mn ≈ 1.2). Healthcare-acquired microbial infections are recognized as the most frequent adverse event in hospitals with dramatic associated consequences. This fact is even more serious, considering the current increase rate of microbial resistance development and the declining discovery of new antibiotics. In this regard, there is an urgent need to develop innovative approaches able to prevent or reduce the rate of acquisition of infections. One promising approach for the efficient elimination of bacteria is based on the use of antimicrobial polymers that present several advantages over conventional treatments, which include broad-spectrum antimicrobial activity and a microbial inactivating mechanism that is not prone to resistance development. In this work, SARA ATRP was used for the preparation of new linear and star-shaped amphiphilic cationic copolymers, based on poly(butyl acrylate) (PBA) and poly((3-acrylamidopropyl)trimethylammonium chloride) (PAMPTMA) with well-defined composition, topology and molecular weight (MW). The antimicrobial efficacy of the novel polymeric systems was evaluated against three different strains of bacteria causing nosocomial infections (Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa) and two Bacillus strains (Bacillus cereus and Bacillus subtilis). The systematic study relating polymer features with antimicrobial efficacy was conducted and it was found that antimicrobial activity increased with increasing MW. To understand the inactivating mechanism of the novel antimicrobial system, membrane cell integrity assays using E. coli were performed and the results revealed a bactericidal behavior by the polymers through bacterial cell membrane disruption. Antimicrobial photodynamic inactivation (aPDI) uses photosensitizers (PS), which are activated upon visible light absorption, to produce reactive oxygen species (ROS) that can cause several irreversible damages to the bacteria cells. The methodology has been explored in the biomedical filed, mostly for the treatment of localized infections and more recently, to produce light-activated polymeric materials aiming to prevent bacterial infections. In this project, three different PS molecules, namely curcumin, proflavine and toluidine blue O (TBO) had their PDI activity evaluated against five different bacteria (the same subjected to the study of the antimicrobial polymers). In the first part of the study, light-assisted assays in liquid medium were performed to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of the PS molecules, using three LED light sources (white, blue and red) and varying both the light intensity and the exposure time aiming to evaluate the influence of these parameters on the antimicrobial activity of the PS. This allowed to establish experimental conditions for further analysis of the polymers containing PS in their structure or polymer/PS mixtures. In general, the results revealed that Gram-positive bacteria were more susceptible to the action of the PS molecules, presenting lower MIC values than the ones obtained against Gram-negative under similar conditions. Also, an improvement on the antimicrobial activity was observed for tests using light with specific wavelengths (blue light or red light), according to the maximum absorption of each PS, and at high-mode intensity energy. Next, the synergistic effects of simple mixtures of polymers (PAMPTMA-Br or PAMPTMA-co-PBA-Br) and PS molecules (curcumin, proflavine and TBO) were investigated against E. coli. Each antimicrobial agent was used below its MIC value, and it was found that at certain polymer/PS ratios, the mixture could inhibit the E. coli growth. Another strategy to evaluate the synergistic antimicrobial effect of polymer/PS concerned the preparation of polymers containing one PS molecule covalently bonded to the polymeric structure. To achieve this, derivatives based on curcumin and proflavine were synthesized and used as ATRP initiators. Here, a library of non-functionalized and PS-initiated cationic PAMPTMA-Br homopolymers and amphiphilic PAMPTMA-co-PBA-Br copolymers were prepared, and the samples were tested against the five microorganisms selected for this project. To investigate if PS-polymers could exhibit light-mediated activity, the assays were performed under dark and light (blue and white) conditions, but no significant differences on the MIC values were observed. The quantity of PS molecule present in the material was very low (one PS molecule per polymeric chain) and probably the quantity of ROS generated was not enough to cause lethal toxicity for the bacteria. The last part of the light-assisted study was dedicated to the evaluation of the potential of the polymeric system developed during this PhD project to be used as an additive for varnish formulations to produce surfaces with antimicrobial activity. Several glass surfaces coated with varnishes containing non-functionalized polymers, PS-polymers and polymers/PS mixtures in different amounts were prepared and the antimicrobial activity against E. coli was evaluated under dark and under light (blue and white). The results revealed that the surfaces displayed a photoantimicrobial action, achieving the highest activity for surfaces prepared with the PAMPTMA/curcumin mixture and exposed to blue light.Resumo Este trabalho visou desenvolver um novo sistema antimicrobiano utilizando activador suplementar e agente redutor da polimerização por radicais de transferência de átomo (SARA ATRP) com potencial para ser aplicado em formulações de revestimento e para preparar superfícies antimicrobianas inovadoras. Era também um objectivo estudar um novo ligante para ATRP catalisado por metal como alternativa mais acessível para outros ligantes normalmente utilizados em ATRP. A nível científico, ATRP é uma das técnicas de polimerização radicalar por desactivação reversível (RDRP) mais utilizada para a preparação de polímeros com estruturas complexas e bem definidas. No entanto, um dos problemas associados à expansão desta técnica para um cenário industrial é o alto custo dos ligantes à base de azoto, que são indispensáveis nestas polimerizações. Assim, o desenvolvimento de novos sistemas ATRP usando ligantes economicamente acessíveis é um passo-chave que pode contribuir para a preparação viável de polímeros controlados em larga escala. Neste projeto, pela primeira vez, N,N,N',N'-tetrametil guanidina (TMG) foi usada como ligante para o SARA ATRP de vários metacrilatos, como metacrilato de metilo (MMA), metacrilato de glicidilo (GMA), metacrilato de etilo (EMA), metacrilato de butilo (BMA) e metacrilato de 2-(diisopropilamino)etilo (DPA). Resultados cinéticos reproduzíveis foram somente obtidos após a adaptação dos procedimentos de preparação e desgaseificação da reacção, a fim de evitar a interação entre iniciador e TMG. Após a otimização do procedimento, o controlo sobre as polimerizações observado foi semelhante ao obtido com outros ligantes frequentemente empregados em ATRP (Mw/Mn ≈ 1.2). A influência do grau de polimerização (DP) e do rácio iniciador/TMG na polimerização foi investigada e os resultados mostraram que a velocidade de polimerização diminuiu com o aumento do DP e que a eficiência de iniciação aumentou com a diminuição do rácio iniciador/TMG. Estudos de voltametria cíclica foram realizados para comprovar a formação e a estabilidade dos complexos CuI/TMG. A alta funcionalidade de final de cadeia de PMMA-Br foi comprovada por auto-extensão de cadeia e através da copolimerização em bloco usando BMA como monómero do segundo segmento, com notável concordância entre Mnth e MnSEC e baixa dispersividade (Mw/Mn ≈ 1.2). Além disso, polimerizações conduzidas na ausência de Cu0 (agente SARA) mostraram que a TMG é capaz de atuar simultaneamente como ligante para a coordenação do metal e como agente redutor, produzindo PMMA-Br bem definido (Mw/Mn ≈ 1.2). As infeções microbianas adquiridas em casas de saúde são reconhecidas como um evento adverso muito frequente, associado a diversas consequências dramáticas. Este facto torna-se ainda mais preocupante, tendo em conta a actual crescente taxa de desenvolvimento de resistência microbiana e a descoberta declinante de novos antibióticos. Neste sentido, há uma séria urgência para desenvolver abordagens inovadoras capazes de prevenir ou reduzir a taxa de aquisição de infeções nosocomiais. Uma estratégia promissora para a eliminação eficiente de bactérias baseia-se no uso de polímeros antimicrobianos que apresentam várias vantagens comparativamente com tratamentos convencionais, incluindo atividade antimicrobiana de amplo espectro e um mecanismo de inativação microbiana que não é propenso ao desenvolvimento de resistência. Neste trabalho, a técnica de SARA ATRP foi utilizada para a preparação de novos copolímeros catiónicos anfifílicos lineares e em forma de estrela, baseados em poli(acrilato de butilo) (PBA) e cloreto de poli((3-acrilamidopropil trimetilamónio) (AMPTMA) com composição, topologia e peso molecular (MW) bem definidos. A eficácia antimicrobiana do novo sistema polimérico foi avaliada contra três estirpes de bactérias comumente associadas a infeções nosocomiais (Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosas) e duas espécies de Bacillus (Bacillus cereus ee Bacillus subtilis). Foi realizado um estudo sistemático que permitiu relacionar as características do polímero com a eficácia antimicrobiana, verificando-se que a mesma aumentou com o aumento do MW. Para entender o mecanismo de inativação microbiano, foram realizados ensaios de integridade da membrana celular bacteriana, com bactérias E. coli, tendo os resultados revelado um comportamento bactericida por rompimento da membrana bacteriana. A inactivação fotodinâmica antimicrobiana (aPDI) utiliza fotossensibilizadores (PS), que são activados na absorção de luz visível, para produzir espécies reactivas de oxigénio (ROS) e que podem causar vários danos irreversíveis às células bacterianas. A metodologia tem sido explorada no campo biomédico, principalmente para o tratamento de infecções localizadas e, mais recentemente, para produzir materiais poliméricos activados à luz com o objectivo de prevenir infecções bacterianas. Neste projecto, três moléculas diferentes de PS, nomeadamente curcumina, proflavina e azul de toluidina O (TBO) tiveram a sua actividade de PDI avaliada contra cinco bactérias diferentes (as mesmas submetidas ao estudo dos polímeros antimicrobianos). Na primeira parte do estudo, foram efectuados ensaios com luz assistida em meio líquido para determinar a concentração inibitória mínima (MIC) das moléculas PS, utilizando três fontes de luz LED (branca, azul e vermelha) e variando tanto a intensidade da luz como o tempo de exposição com o objectivo de avaliar a influência destes parâmetros na actividade antimicrobiana dos PS. Isto permitiu estabelecer condições experimentais para uma análise mais aprofundada dos polímeros que contêm PS na sua estrutura ou das misturas de polímeros/PS. Em geral, os resultados revelaram que as bactérias Gram-positivas eram mais susceptíveis à acção das moléculas de PS, apresentando valores MIC inferiores aos obtidos contra as Gram-negativas, em condições semelhantes. Também se observou uma melhoria da actividade antimicrobiana nos testes que utilizaram luz com comprimentos de onda específicos (luz azul ou vermelha), de acordo com a absorção máxima de cada PS, e utilizando energia de alta intensidade. Em seguida, foram investigados os efeitos sinergísticos das misturas simples de polímeros (PAMPTMA-Br ou PAMPTMA-co-PBA-Br) e moléculas de PS (curcumina, proflavina e TBO) contra a E. coli. Cada agente antimicrobiano foi utilizado abaixo do seu valor de MIC, tendo-se constatado que, em certos rácios polímero/PS, a mistura poderia inibir o crescimento da E. coli. Outra estratégia para avaliar o efeito antimicrobiano sinergético do polímero/PS dizia respeito à preparação de polímeros contendo uma molécula de PS ligada de forma covalente à estrutura polimérica. Para tal, foram sintetizados derivados à base de curcumina e proflavina, que foram utilizados como iniciadores de ATRP. Aqui foi preparada uma biblioteca de homopolímeros PAMPTMA-Br catiónicos não funcionalizados e iniciados por PS e copolímeros anfifílicos PAMPTMA-co-PBA-Br, tendo as amostras sido testadas contra os cinco microrganismos seleccionados para este projecto. Para investigar se os polímeros PS podiam exibir actividade mediada pela luz, os ensaios foram realizados em condições em escuro e com luz (azul e branco), mas não foram observadas diferenças significativas nos valores do MIC. A quantidade de molécula de PS presente no material foi muito baixa (uma molécula de PS por cadeia polimérica) e provavelmente a quantidade de ROS gerada não foi suficiente para causar toxicidade letal para as bactérias. A última parte do estudo realizado na presença de luz foi dedicada à avaliação do potencial do sistema polimérico desenvolvido durante este projecto de doutoramento para ser utilizado como aditivo em formulações de verniz e para produzir superfícies com actividade antimicrobiana. Foram preparadas várias superfícies de vidro revestidas com vernizes contendo polímeros não funcionalizados, PS-polímeros e misturas de polímeros/PS em diferentes quantidades e a actividade antimicrobiana contra E. coli foi avaliada em escuro e com luz (azul e branco). Os resultados revelaram que as superfícies apresentavam uma acção fotoantimicrobiana, obtendo a maior actividade para superfícies preparadas com a mistura PAMPTMA/curcumina e expostas à luz azul.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq