Diversity, Phylogeny and Pigment Studies of Eustigmatophyceae, a Poorly Known Group of Microalgae

Doctoral thesis in Biosciences, specialization in Microbiology, presented to the Life Sciences Department of the Faculty of Sciences and Technologyof the University of Coimbra.The microalgal class Eustigmatophyceae was established in 1970 by the transfer of organisms previously included in the Xanthophyceae, due to their unique vegetative and reproductive cell structure. Differences in pigment content confirmed the separation of mostly freshwater microalgae with yellow-green chloroplasts. During the following four decades, morphological, pigment and molecular studies were focused in the reduced number of taxa which were attributed to the class, which limited progress in its knowledge. The selective isolation of potentially new taxa originated a high number of understudied genera held at Coimbra Collection of Algae (ACOI). The objectives of this work were defined with a focus on the taxa held at ACOI and consisted in (1) the application of a polyphasic approach combining morphological studies with molecular data for confirming their position in class eustigmatophyte and for revealing their phylogeny and (2) to determine the pigment content of the strains in order to complement the study and to verify the typical eustigmatophyte pigment profile with a focus on the carotenoids with potential biotechnological interest. In order to clarify the taxonomy and phylogeny of understudied taxa, the ACOI genera Characiopsis and Pseudostaurastrum were selected. Optical and electronic microscopical techniques were used for obtaining morphological data. For taxonomy and phylogeny studies, 18S rRNA gene sequences were obtained for backbone overview of the phylogeny, and rbcL gene sequences for allowing the determination of internal phylogeny. The cytological and molecular studies revealed that the large genus Characiopsis belongs to the Eustigmatophyceae rather than the Xanthophyceae. Strains of C. ovalis, C. minima and C. aquilonaris are positioned in the new familial lineage, the Neomonodaceae fam. nov. which includes organisms devoid of a pyrenoid with previous names rendered synonyms of the newly established taxa. Other strains with Characiopsis morphology namely C. pernana, C. acuta, C. longipes, C. minutissima, C. cedercreutzii, were also proved to be eustigmatophytes and the genus was formally transferred from the Xanthophyceae to the Eustigmatophyceae. The genus Pseudostaurastrum was already known to be a deep monophyletic lineage of the ordinal clade Goniochloridales, however with only two known strains. This genus was enlarged with the present study. The unique ACOI collection of these sensitive and rare organisms enabled a broader phylogenetic overview of this genus and its monophyly was proven by rbcL gene analysis. The determination of the pigment content of 27 strains belonging to 10 different genera was performed by high performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC-DAD). The characteristic eustigmatophyte pattern was confirmed, with the detection of chlorophyll a and no chlorophyll b, and the three major carotenoids namely from the most to the least abundant: violaxanthin, vaucheriaxanthin and β-carotene. The study revealed high amount of violaxanthin, representing around half the total pigments in Monodopsis unipapilla ACOI 2938. The low light conditions in cultivation of these strains is the factor pointed out as justifying the high content in this carotenoid. The pigment profile of Neomonodaceae and Characiopsis strains was obtained for the first time. The main conclusions are that the genus Characiopsis belongs to the Eustigmatophyceae and it was polyphyletic in its previous form. Some strains are positioned in the Eustigmataceae group and retain the generic name Characiopsis while others compose the new family Neomonodaceae fam. nov., and distribute by the genera Neomonodus gen. nov., Pseudellipsoidion, Characiopsiella gen. nov., Munda gen. nov., devoid of a pyrenoid. Genus Pseudostaurastrum was understudied and it is now enlarged in 19 strains, with 3 new molecular groups, corresponding to P. hastantum, P. lobulatum and a third taxonomically undetermined group. The eustigmatophyte pigmentary profile was consolidated, in all studied strains chlorophyll a, violaxanthin, vaucheriaxanthin and β-carotene were detected. The relative quantification showed that the eustigmatophyceae are rich in violaxanthin, the most abundant carotenoid in the studied strains. With this study, the class Eustigmatophyceae enlarged significantly, with the addition of 66 new strains, 55 of which are ACOI isolates and 10 are cultures from other collections. Is is also now known that the pigmentary profile of the eustigmatophytes is consistent and the strains were screened, and the best producers of biotechnologically interesting strains were listed.A classe de microalgas Eustigmatophyceae foi estabelecida em 1970 devido à transferência de organismos previamente incluídos na classe Xanthophyceae, cuja estrutura celular de células vegetativas e reprodutoras se apresentava única. Diferenças pigmentares corroboraram esta separação de microalgas predominantemente de água doce e que exibem uma cor verde-amarelada dos seus cloroplastos. Durante cerca de quatro décadas, os estudos morfológicos, pigmentares ou moleculares focaram-se num número muito reduzido de taxa atribuídos à nova classe, o que condicionou o progresso no seu conhecimento. O isolamento seletivo de potenciais novos taxa permitiu que presentemente a Algoteca de Coimbra (ACOI) detenha um elevado número de estirpes de géneros pouco estudados. Assim, os objetivos deste trabalho foram definidos com foco nos taxa existentes em ACOI e consistiram em (1) aplicar uma abordagem polifásica ao seu estudo, combinando dados morfológicos com dados moleculares, para confirmar a sua posição na classe Eustigmatophyceae e revelar a sua filogenia e (2) determinar o conteúdo pigmentar das estirpes para complementar a abordagem anterior e verificar o perfil típico da classe, focando o conteúdo em carotenoides de potencial interesse biotecnológico. Para clarificar a taxonomia e filogenia dos taxa pouco estudados, foram selecionadas estirpes ACOI dos géneros Characiopsis e Pseudostaurastrum. Foram utilizadas técnicas de microscopia ótica e eletrónica para obtenção de dados morfológicos. Para o estudo taxonómico e filogenético sequenciaram-se o gene nuclear 18S rRNA, para a obtenção da filogenia da classe e o gene cloroplastidial rbcL gene, para filogenia com maior resolução. Os estudos citológicos e moleculares revelaram que o género Characiopsis pertence à classe Eustigmatophyceae e não à classe Xanthophyceae. As estirpes de C. ovalis, C. minima and C. aquilonaris posicionam-se numa linhagem nova, a família Neomonodaceae fam. nov. que passa a incluir organismos cujas células não possuem pirenoide, ficando os nomes anteriores como sinónimos de géneros estudados. A nova família contém quatro géneros, um destes, Pseudellipsoidion, foi reavaliado e a taxonomia atualizada, e três novos géneros, Neomonodus gen. nov., Characiopsiella gen. nov. e Munda gen. nov.. Ficou provado que outras estirpes, nomeadamente C. pernana, C. acuta, C. longipes, C. minutissima e C. cedercreutzii são eustigmatofíceas e o género Characiopsis foi formalmente transferido da classe Xanthophyceae para a classe Eustigmatophyceae. O género Pseudostaurastrum, reconhecido como uma linhagem filogenética profunda do grupo ordinal Goniochloridales, com duas estirpes conhecidas, foi ampliado com o presente estudo. A coleção única de estirpes ACOI permitiu a obtenção de árvores filogenéticas mais completas do género e confirmar a sua monofilia por análise do gene rbcL. A determinação do conteúdo pigmentar de 27 estirpes pertencentes a 10 géneros diferentes, por cromatografia líquida de alta performance com detetor de fotodíodos (HPLC-DAD), permitiu confirmar o padrão pigmentar típico das eustigmatofíceas, com clorofila a, ausência de clorofila b, e três pigmentos mais abundantes, por ordem decrescente: violaxantina, vaucheriaxantina e β-caroteno. Foram determinados valores elevados de violaxantina, representando cerca de metade do total de pigmentos em Monodopsis unipapilla ACOI 2938. O cultivo em baixa luminosidade é o fator apontado para a obtenção dos valores elevados neste carotenoide. O perfil pigmentar de estirpes de Neomonodaceae e de Characiopsis foi obtido pela primeira vez. As conclusões principais são que o género Characiopsis pertence à classe Eustigmatophyceae e na sua forma anterior era polifilético. Algumas espécies posicionam-se no Eustigmataceae group e retêm o nome genérico Characiopsis, enquanto outras compõem a nova família Neomonodaceae fam. nov., distribuindo-se pelos géneros Neomonodus gen. nov., Pseudellipsoidion, Characiopsiella gen. nov., Munda gen. nov., não tendo sido detetado pirenoide nestes organismos. O género Pseudostaurastrum era anteriormente pouco estudado, foi agora ampliado em 19 estirpes, aumentando a diversidade em mais três grupos moleculares, correspondendo a P. hastantum, P. lobulatum e um terceiro sem atribuição taxonómica. Ficou consolidado o perfil pigmentar das eustigmatofíceas, em todas as estirpes estudadas foi detetada clorofila a, violaxantina, vaucheriaxantina e β-caroteno. A quantificação relativa mostrou que as eustigmatofíceas são ricas em violaxantina, sendo sempre o carotenoide mais abundante nas estirpes estudadas. Com este estudo, a classe Eustigmatophyceae aumentou significativamente, com a adição de 66 novas estirpes, 55 das quais isoladas e mantidas em ACOI e 10 estirpes de outras coleções. É também agora sabido que o perfil pigmentar das eustigmatofíceas é consistente, tendo ficando triadas as melhores produtoras de pigmentos com potencial uso em biotecnologia