Revestimento de sementes com inoculantes microbianos: um caminho para agricultura sustentável

Tese no âmbito do Doutoramento em Biociências, ramo de especialização em Biotecnologia, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e tecnologia da Universidade de Coimbra.The interest in plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) and arbuscular mycorrhizal (AM) fungi for agricultural purposes (e.g. enhancement of crop yield and nutrition, promotion of plants resilience to abiotic stress) is rising. Yet, large-scale applications of these microbes have been hampered by the lack of data on their field performance and the feasibility of the inoculation methods, especially in the case of AM fungi. Seed coating, a technique in which seeds are covered with minor amounts of exogenous materials (including microbial inoculants), is a potential tool to deliver microbes at large-scale. This technique has been gaining attention in the agricultural sector. A literature review revealed that seed coating has been applied to more than 50 plant species (e.g. wheat, tomato, maize, melon, bean, clover), including seeds with different characteristics (dimensions, forms, textures). Mostly studied for the application of various species of PGPR (especially from the genera Pseudomonas and Bacillus), seed coating is not so frequently explored for inoculation of AM fungi or microbial consortia. The improvement of crop productivity and protection of plants against pathogens have been the main focus of research on microbial seed coating, while a smaller portion has been aimed at enhancing crops resistance to abiotic stresses. One of the main goals of this PhD thesis was to evaluate seed coating as a deliver system for the inocula of AM fungi and PGPR. Overall, seed coating allowed the application of minor amounts of AM fungi and PGPR to the seeds of three selected agricultural crops: maize, cowpea and chickpea. Further, by comparing inoculation of AM fungi through direct soil inoculation (conventional) with seed coating, similar AM root colonization was obtained despite a reduction in the amount of applied inocula. Contrary to AM fungi, the presence of PGPR coated on the seeds could not be confirmed in the rhizosphere and roots of the inoculated crops. It is well known that both AM fungi and PGPR have the ability to improve soil fertility and enhance plant nutrition, which can bring benefits for plant growth and development. By increasing nutrient availability and nutrient use efficiency, these plant beneficial microbes (PBM) can assist farmers to reduce their dependence on chemical fertilizers. The results obtained in this thesis showed that coating seeds with PGPR and AM fungi had a significant impact on plant shoot nutrient concentrations under different fertilization regimes. For instance, maize seeds coated with AM fungi (Rhizophagus irregularis) increased shoot nutrient concentration (nitrogen, phosphorus, potassium, magnesium and zinc), comparing with non-inoculated plants. Nutrient contents on maize shoot were boosted by R. irregularis inoculation, particularly in the treatments where fertilization was reduced or absent. On the contrary, maize coated with PGPR (Pseudomonas fluorescens) presented most of the nutritional increments when full fertilization was applied. Nevertheless, in both inoculation treatments, despite the nutrient enhancements, no improvement in plant biomass was obtained. These results confirm that PBM can increase plant nutrient uptake. PGPR and AM fungi are known to confer drought resistance to plants. Coating seeds with PGPR (Pseudomonas putida) showed a general positive influence in the plant productivity, especially under moderated water deficit. Seed coating with AM fungi (R. irregularis singly or in consortia with P. putida) promoted nutrient uptake, leaf pigment contents and gas exchange parameters of cowpea, yet mostly when plants where under no water deficit. Mainly, these results emphasized the importance of selecting the PBM that better potentiate plant resilience to abiotic stresses, in order to obtain the best benefits from the inoculation. Field experiments are essential to validate the benefits of microbial seed coating and its feasibility for large-scale applications. A comparison between chickpea coated with a single AM fungal isolate of R. irregularis and multiple isolates of the same fungal species under greenhouse and field conditions showed that plants inoculated with multiple AM fungal isolates performed better (e.g. higher biomass, increased grain yield) than those inoculated with a single AM isolate. Seed coating proved to be an appropriate tool to deliver AM fungi with benefits for chickpea plants at both experimental scales, but particularly relevant under field conditions. The mixture of multiple R. irregularis isolates was also used in consortium with Pseudomonas libanensis for coating cowpea seeds. This treatment significantly improved crop productivity in comparison with non-inoculated plants and plants inoculated with R. irregularis single-isolate + P. libanensis. The results showed improvements in grain lipid content, soil physicochemical properties (pH and soil organic matter), and crop yield under low-input agricultural systems. AM fungi and PGPR should be selected for microbial seed coating formulation according to their affinity with the host crop, growing conditions (e.g. soil properties) and farming practice (e.g. irrigation and fertilization), in order to obtain economical profits. This thesis is a contribution to the knowledge on microbial seed coating and highlights the potential of seed coating as a microbial delivery tool and the benefits of its use in different agricultural conditions. Microbial seed coating can be of great use for sustainable agricultural systems. Yet, in order to allow its large-scale application as a cost-effective technique for PGPR and AM fungi inoculation, further development is necessary.O interesse em rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCP) e fungos arbusculares micorrízicos (FAM) para fins agrícolas (e.g. melhoramento do valor nutricional e rendimento de culturas, promoção de resiliência de plantas a factores abióticos) tem vindo a aumentar. Contudo, a aplicação em larga escala destes microrganismos tem sido dificultada pela escassez de dados sobre a performance destes em campo e viabilidade dos métodos de inoculação, em particular, no caso dos FAM. O revestimento de sementes, uma técnica que consiste em cobrir sementes com pequenas quantidades de materiais exógenos (incluindo inoculantes microbianos), representa uma potencial ferramenta para inocular microrganismos em grande escala. O revestimento de sementes tem vindo a ganhar importância no sector agrícola. Segundo a revisão da literatura realizada nesta tese, o revestimento de sementes foi usado em mais de 50 espécies de plantas (e.g. trigo, tomate, milho, melão, feijão, trevo), abrangendo sementes com diferentes características (dimensões, formas, texturas). Principalmente estudado para aplicação de várias espécies de RPCP (em particular do género Pseudomonas e Bacillus), o revestimento de sementes não tem sido tão frequentemente usado para inoculação dos FAM ou consórcios microbianos. O aumento da produtividade e proteção de culturas agrícolas contra agentes patogénicos têm sido o principal foco da investigação sobre revestimento de sementes com microrganismos benéficos. Por outro lado, os estudos referentes ao melhoramento da resistência de plantas a stresses abióticos através do revestimento de sementes têm sido consideravelmente menores. Um dos principais objectivos desta tese foi avaliar a técnica de revestimento de sementes como método de inoculação para FAM e RPCP. De uma forma geral, o revestimento de sementes permitiu a aplicação de pequenas quantidades de FAM e RPCP em sementes de três culturas: milho, feijão-frade e grão-de-bico. Uma comparação entre inoculação directa no solo (convencional) e revestimento de sementes com FAM, mostrou que, apesar da redução na quantidade de inoculo aplicado, a eficiência do fungo na colonização nas raízes da planta alvo foi similar. Contrariamente aos FAM, a presença de RPCP na rizosfera e raízes das culturas selecionadas não foi confirmada. É de conhecimento geral que tanto os FAM como RPCP têm a capacidade de melhorar a fertilidade do solo e o estado nutricional das plantas, o que pode ser de grande proveito para o desenvolvimento e crescimento destas. Através do aumento da disponibilidade ou eficiência de utilização dos nutrientes, estes microrganismos promotores de crescimento de plantas (MPCP) podem ajudar os agricultores a reduzir a dependência de fertilizantes sintéticos. De acordo com os resultados obtidos nesta tese, sementes revestidas com RPCP e FAM tiveram um impacto significativo no estado nutricional das plantas quando submetidas a diferentes regimes de fertilização. Por exemplo, sementes de milho revestidas com FAM (Rhizophagus irregularis) apresentaram um aumento significativo na concentração de nutrientes na parte área (azoto, fósforo, potássio, magnésio e zinco), quando comparado com plantas não inoculadas. A concentração de nutrientes, na parte área do milho, foi estimulada pela inoculação de R. irregularis, em particular, em tratamentos com fertilização reduzida ou ausente. Pelo contrário, o aumento na concentração de nutrientes em milho revestido com RPCP (Pseudomonas fluorescens) foi superior quando plena fertilização foi aplicada. Contudo, apesar do incremento nutricional, em geral, não se verificaram aumentos a nível da biomassa da planta em ambas as inoculações. Estes resultados confirmam que os inoculantes podem influenciar de forma positiva a absorção de nutrientes pelas plantas. RPCP e FAM são conhecidos por conferir resistência a plantas sobre stress hídrico. O revestimento de sementes com RPCP (Pseudomonas putida) mostrou, em geral, um efeito benéfico na productividade do feijão-frade, em especial, quando submetido a deficit hídrico moderado. Por sua vez, o revestimento de sementes com FAM (R. irregularis) individual ou em consórcio com P. putida promoveu a absorção de nutrientes pela planta, o conteúdo de pigmentos nas folhas e parâmetros de troca gasosa, contudo, na sua maioria na ausência de stress hidríco. Estes resultados realçam a importância de selecionar os MPCP que melhor fomentem a resiliência das plantas a stresses abióticos, a fim de tirar melhor partido da inoculação. Experiências de campo são indispensáveis para corroborar os benefícios do revestimento de sementes com microrganismos e a viabilidade para aplicações em grande escala. Uma comparação entre grão-de-bico revestido com um único isolado de R. irregularis e com uma mistura de vários isolados de R. irregularis, em estufa e em campo, mostrou que as plantas revestidas com múltiplos isolados tiveram um melhor desempenho (e.g. incremento na biomassa e na produção de grão). O revestimento de sementes mostrou ser uma ferramenta adequada para a inoculação de FAM com vantagens para a produção de grão-de-bico em ambas as escalas experimentais, em particular, para as condições de campo. A mesma mistura de isolados de R. irregularis foi usada em consórcio com Pseudomonas libanensis para revestir sementes de feijão-frade. Este tratamento aumentou significativamente a produtividade da cultura em comparação com plantas não inoculadas e plantas inoculadas com único tipo de isolados de R. irregularis + P. libanensis. Os resultados revelaram melhoramentos no conteúdo lipídico das sementes, nas propriedades físico-químicas do solo (pH e matéria orgânica do solo) e no rendimento da cultura, num sistema agrícola de baixo input. FAM e RPCP devem ser selecionadas de acordo com a sua afinidade com a planta alvo, condições de cultivo (e.g. propriedades do solo) e práticas agrícolas (e.g. irrigação, fertilização), de forma a obter lucros. Esta tese contribui para aumentar o conhecimento sobre revestimento de sementes com microrganismos, e realça o potencial da técnica como ferramenta de inoculação de FAM e RPCP e os seus benefícios em diferentes condições agrícolas. O revestimento de sementes com microrganismos pode ser de grande interesse para sistemas agrícolas sustentáveis. Contudo, de forma a permitir o uso em larga escala, como um método eficiente para a inoculação de RPCP e FAM, é necessário apostar no seu melhoramento e desenvolvimento