Caracterização de imunógeno para fim de produção de soro antiloxoscélico utilizado no Sistema Único de Saúde : estudos bioquímicos e de estabilidade dos venenos de aranhas do gênero Loxosceles

Orientadora: Prof. Dra. Olga Meiri ChaimCoorientadores: Prof. Dra. Andrea Senff Ribeiro, Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 01/02/2017Inclui referências: p. 81-92Resumo: As picadas de aranhas-marrons, como são popularmente conhecidos os aracnídeos do gênero Loxosceles, são um agravo de Saúde Pública não apenas no Brasil, mas também em outros países de todo o mundo. Embora se utilizem várias classes medicamentosas na abordagem terapêutica do acidentado, o único tratamento específico capaz de neutralizar a ação do veneno é o Soro Antiloxoscélico, produzido por apenas um laboratório no Brasil: o Centro de Produção e Pesquisa de Imunobiológicos - CPPI. O soro, distribuído no Sistema Único de Saúde - SUS é produzido a partir do processamento industrial-farmacêutico do plasma de equinos imunizados com os venenos das aranhas L. gaucho, L. intermedia e L. laeta, as três espécies de maior importância médica no país. Para a imunização dos cavalos, o CPPI produz soluções de veneno das três espécies citadas. Durante seu processo de produção, torna-se imprescindível um controle de qualidade eficiente com a comparação dos lotes fabricados com um padrão de referência, a fim de atestar que os antígenos possuem componentes idênticos àqueles encontrados nos animais causadores de acidentes e que são imunogênicos, com capacidade de estimular o sistema imune de equinos para a produção de anticorpos específicos frente às toxinas dos venenos. Em vista disso, foram realizados ensaios visando à caracterização dos perfis proteicos, enzimáticos, imunoquímicos e estabilidade dos venenos das três espécies de Loxosceles utilizadas na produção do soro antiveneno durante nove meses, para sua posterior aplicação na rotina dos Controles de Qualidade da produção de venenos. Foi possível observar diferenças entre os perfis eletroforéticos dos venenos das aranhas do gênero Loxosceles, bem como se notou a diminuição de intensidade de algumas bandas proteicas com o passar do tempo. A atividade proteásica averiguada através de zimograma em gelatina foi constatada em todos os venenos durante os nove meses de testes, com a seguinte ordem crescente de ação proteolítica: L. gaucho < L. intermedia < L. Laeta. A mesma ordem de degradação de gelatina também foi observada em ensaio para determinação quantitativa da atividade metaloproteásica, realizado em seguida à produção (Tempo 0) dos venenos obtidos em 2016. As atividades hialuronidásica e fosfolipásica também se mostraram presentes em todas as espécies até nove meses pós-produçao. Entretanto, a ação das fosfolipases pareceu diminuir a partir do terceiro mês de observação quando comparado como Tempo 0, porém tal dado não pode ser considerado como fator de exclusão dos venenos a serem empregados na imunização de equinos, uma vez que esta família de toxinas ainda se mostrou presente. Todos os venenos mostraram-se imunogênicos até três meses depois de produzidos em análises realizadas por Western-blotting com diferentes soros, incluindo o Soro Antiloxoscélico. Desta maneira, é possível afirmar que os antígenos produzidos e utilizados pelo CPPI dentro do processo produtivo do Soro Antiloxoscélico mantêm conservadas as principais características bioquímicas e imunoquímicas dos venenos loxoscélicos, sendo adequados para utilização dentro do tempo analisado na imunização de animais, bem como as técnicas padronizadas apresentadas podem ser empregadas em controles de qualidade da produção dos venenos. Palavras-chave: Loxosceles, CPPI, Soro Antiloxoscélico.Abstract: Bites of arachnids of the Loxosceles genus- popularly known as "brown spiders"- are considered to be a public health problem in Brazil. Although, many drug classes are used therapeutically, the only specific neutralizing treatment to the actions of the venom is the Antiloxosceles Serum, which is exclusively produced in Brazil by the Immunobiological Production and Research Center (CPPI). The serum, which is distributed into the Public Health System, is roused from the industrial plasma processing of the equines injected with the venoms of L. gaucho, L. intermedia e L. laeta, the three most important species of brown spiders in Brazil. For horse immunizations, CPPI produces the venom solutions of the three spider species. During the venom processing an efficient quality control aiming to maintain the properties of the venom batches is critical. In this way, a venom profile as reference pattern is indispensable for comparison purposes. It is necessary to certify venom antigens possess identical features to those on the accident-causing animals, such as immunogenicity, in order to further raise specific antibodies against venom toxins. Herein, samples of venom were essayed during nine months seeking to establish the protein, enzyme, immunochemical and stability profiles of Loxosceles venoms from the three species used by CPPI in the production of the antivenom and the later application of these techniques on the routine of the quality control of the immunogens. It was observed differences among the eletrophoretic a profile of the venoms from the spiders of the Loxosceles genus, as well as it was noticed the loss of intensity of some protein bands as the samples were older. The proteolytic activity verified by zymogram with gelatin was evidenced in all venoms during the nine months of tests with the following crescent order of proteolytic action: L. gaucho < L. intermedia < L. laeta. The same gelatin degradation order was also observed on the essay of metalloprotease activity carried out right after the production of the venoms from 2016 (Time 0). The hyaluronidase and phospholipase activities were present in all venoms until nine months after their production. However, the phospholipasse activity reduced from the third month of production. This result must not be considered as an exclusion factor of the venoms to be used on the immunization of horses, once this toxin family is still present in the samples. All the venoms were recognized by Western-blotting analysis by different sera including the Antiloxosceles Serum after three months oftheir production. Furthermore, it was demonstrated that the venoms produced by CPPI and used in the production of the Antiloxosceles Serum mantain the main biochemical and immunochemical properties of the Loxosceles venoms. They showed to be adequate for utilization on immunizations within the time studied (nine months). The techniques here presented can also be applied on the venom production for quality controls purposes, Key-words: Loxosceles, CPPI, Antiloxoscelic Serum