Infektionen pädiatrischer Patienten durch Streptokokken der Gruppe A: Klinische Charakteristika und molekular-epidemiologische Erregeranalyse

Obwohl seit der Einführung des Penicillins ein wirksames Medikament gegen Streptokokken der Lancefield Gruppe A (GAS) existiert, bei welchem bislang keine Resistenzen beschrieben wurden, bleiben GAS-Infektionen auch heute noch ein großes gesundheitspolitisches Problem, das sowohl die Morbidität als auch die Mortalität der Menschen weltweit beeinflusst. GAS können ein breites Spektrum an Erkrankungen beim Menschen verursachen. Dazu zählen nicht nur unkomplizierte Racheninfektionen mit und ohne Scharlach oder Hautinfektionen wie Erysipel oder Impetigo, sondern auch invasive sowie Folgeerkrankungen. 1928 wurde als Typ-spezifische, Antikörperbildung-induzierende Substanz das M-Protein beschrieben, welches durch das emm-Gen kodiert und seither zur Beschreibung der Epidemiologie von GAS verwendet wird. Eine der Hauptfunktionen des auf der Oberfläche von GAS verankerten M-Proteins besteht darin, die Phagozytose durch polymorphkernige Leukozyten zu verhindern, was zu den wichtigsten Abwehrmechanismen von Infektionen mit GAS gezählt wird. Obwohl seit einigen Jahrzehnten große Anstrengungen unternommen wurden, bleibt ein sicherer und effektiver Impfstoff bisher ein unerreichtes Ziel. In der hier vorliegenden Studie wurde, anhand der über den Zeitraum vom 11.03.2006 bis 19.05.2012 am Universitätsklinikum Freiburg gesammelten Daten und Isolaten, die regionale Epidemiologie von Infektionen pädiatrischer Patienten durch GAS retrospektiv untersucht. Mit insgesamt 566 Isolaten und zugehörigen klinischen Daten stellt diese Studie die bisher größte unizentrische epidemiologische Untersuchung von pädiatrischen Erkrankungen mit emm-Typisierung von GAS in Deutschland dar. Dabei wurde besonders auf Zusammenhänge zwischen den molekularepidemiologischen Daten, basierend auf der emm-Typisierung, und den anonymisierten klinischen Informationen eingegangen. In die Kohorte konnten insgesamt 566 Fälle eingeschlossen werden. Bei 405 Fällen wurde eine Racheninfektion festgestellt, wovon bei wiederum 75 Fällen zusätzlich die Diagnose Scharlach gestellt wurde, 34 Kinder stellten sich mit einer Hautinfektion vor, 21 mit einer akuten Otitis media, 19 mit einer anogenitalen Infektion, acht mit einer invasiven Infektion und zwei mit einer Harnwegsinfektion. Als Kolonisation durch GAS ohne Krankheitswert wurden 77 Fälle gewertet, davon 48 mit pharyngealer Kolonisation. In der molekularepidemiologischen Untersuchung konnten drei neue emm-subtypen entdeckt werden, welche als emm29.13, emm36.7 sowie emm75.5 erstbeschrieben und deren Sequenzen in der Datenbank des CDC hinterlegt wurden. Über die gesamte Kohorte hinweg wurde Typ emm12 bei 19% aller Fälle gefunden und lag somit am häufigsten vor, gefolgt von emm1 und emm4 mit je 14% sowie emm28 und emm89 mit je 11%. Bei Betrachtung der emm-Cluster zeigte sich E4 mit 31% am häufigsten, danach folgten Cluster A-C4 mit 19%, A-C3 und E1 mit jeweils 14%. Unter den 405 Fällen mit GAS-Tonsillopharyngitis lag emm12 mit knapp 20% am häufigsten vor, gefolgt von emm4 mit 15%, emm1 mit 14%, emm89 mit 13% und emm28 sowie emm3 mit je 9%. Hinsichtlich der Cluster wurde E4 dort mit knapp 30% am häufigsten festgestellt, gefolgt von A-C4 mit 20%, E1 mit 15%und A-C3 mit 14%. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass sich die emm-Typ- sowie die emm-Cluster-Epidemiologie in Abhängigkeit von der klinischen Manifestation unterscheidet. Auch wenn sich die Verteilungen grundsätzlich ähnelten, traten emm4 bzw. die Cluster A-C5 und E1 bei Patienten mit Tonsillopharyngitis mit Scharlach auch nach Bonferroni-Korrektur signifikant häufiger auf als bei solchen mit Tonsillopharyngitis ohne Scharlach. Erste Hinweise hierfür wurden im Rahmen dieser Arbeit in einer Vorabauswertung zu dieser Kohorte 2013 erstmals beschrieben und durch Ergebnisse folgender, internationaler Studien gestützt. Bei anogenitalen Infektionen wurde in knapp 80% der Fälle Cluster E4 und in 58% emm28 festgestellt, so-dass hier ein deutlich eingeengtes Erregerspektrum vorlag. Verglichen zu allen Fällen mit Tonsillopharyngitis wurden bei anogenitaler Infektion Typ emm28 und Cluster E4 signifikant häufiger isoliert. Für Hautinfektionen konnte kein signifikanter Unterschied der emm-Typ-Verteilung im Vergleich zu Racheninfektionen insgesamt gefunden werden. Es zeigte sich jedoch Cluster E4 signifikant häufiger bei Patienten mit einer Hautinfektion als bei solchen mit Scharlach. Insgesamt zeigte sich im konkreten Vergleich zu einer französischen Studie eine weitgehende Übereinstimmung hinsichtlich der Epidemiologie der emm-Typen und -Cluster, jedoch auch einzelne Differenzen. Diese Unterschiede waren signifikant für emm6 und emm22, ebenso wie für Cluster M6. Weiterhin bestätigte unter anderen die Studie von d´Humieres et al. die Häufung von emm4 bei Scharlach-Patienten, was die Aussage der vorgelegten Ergebnisse unter-streicht. Weiterhin wurde zur Untersuchung der longitudinalen Entwicklung der emm-Typen und emm-Cluster die Verteilung des Zeitraumes vom 01.04.2006 und 31.03.2007 mit dem vom 01.05.2011 bis 30.04.2012 verglichen. Zumindest für den vergleichsweise kurzen zeitlichen Abstand konnten nach Adjustierung keine signifikanten Veränderungen der Epidemiologie hinsichtlich einzelner emm-Typen bzw. -Cluster beobachtet werden. In bisherigen Studien wurde die Pathogenität eines Stammes meist anhand des klinischen Erscheinungsbildes bestimmt. In dieser Studie wurde weiterführend untersucht, inwiefern sich einzelne emm-Typen bzw. emm-Cluster auch in quantitativ messbaren Parametern wie u.a. dem C-reaktiven Protein (CRP) sowie der Leukozytenzahl im Blut unterscheiden. Bei Patienten mit Tonsillopharyngitis zeigte sich lediglich Cluster E4 signifikant häufiger mit einem CRP-Wert über 35 mg/l assoziiert. Für die Leukozytenzahl war ein solcher Zusammenhang dagegen nicht nachweisbar. Da die verwendeten Analysen jedoch Störfaktoren unterlagen und ein Kausalzusammenhang zwischen der Pathogenität des Erregers und der Auslenkung der ge-nannten Parameter im Rahmen des Studiendesigns nicht bewiesen werden konnte, lassen diese Ergebnisse keine abschließende Beurteilung zu. Der bereits entwickelte 30-valente Impfstoff zeigte anhand der enthaltenen M-Antigene eine gute Übereinstimmung mit den in dieser Studie gefundenen emm-Typen. Dabei waren die Antigene von 19 der 25 in dieser Studie registrierten emm-Typen in dem Impfstoff enthalten, was jedoch unter Berücksichtigung der Kreuzreaktivitäts-Hypothese für emm-Cluster zu einem Deckungsgrad von 99,8% aller untersuchten Fälle (565 von 566) führt. Insgesamt erwies sich der unizentrische Charakter der hier vorgelegten Studie in gewisser Hinsicht als Vorteil gegenüber multizentrischen Studien, da hierdurch zu bestimmten Fragen Informationen ohne den Einfluss regionaler Besonderheiten ausgewertet werden konnten. Inwiefern regionale Prävalenzen einzelner emm-Typen oder deren Pathogenitätspotential ent-scheidend für die Epidemiologie insbesondere invasiver Infektionen sind, kann anhand dieser Studie nicht abschließend beurteilt werden. Zur näheren Untersuchung dieses Sachverhaltes wären weiterführende Studien in größerem Maßstab notwendig. Zusammenfassend wurde mit dieser Arbeit eine umfassende epidemiologische Untersuchung anhand der molekularepidemiologischen Erregeranalyse unter Einschluss klinischer Aspekte an einer großen pädiatrischen Kohorte durchgeführt. Die gewonnenen Erkenntnisse leisten einen Beitrag zur Aufklärung der regionalen wie auch internationalen Epidemiologie von GAS und bieten wichtige Grundlagen sowie Ansätze für nachfolgende Untersuchungen, insbesondere für die Impfstoffentwicklung gegen GAS.:1 Einleitung 7 2 Theoretische Grundlagen 8 2.1 Epidemiologie 8 2.2 Taxonomie 10 2.3 Infektionspathologie 11 2.4 Aufbau des M-Proteins 14 2.5 Die Bedeutung des M-Proteins 16 2.6 emm-Genetik 18 2.7 Therapie und Prophylaxe 20 3 Ziele der Studie 22 4 Patienten, Material und Methoden 23 4.1 Mikrobiologische Isolate und klinische Daten 23 4.1.1 „Klinische Krankheitsbilder“ 25 4.1.2 Modifizierter Centor-Score 26 4.1.3 Grunderkrankungen 27 4.1.4 Paraklinik 27 4.2 Geräte und Materialien 29 4.2.1 Geräte und Hilfsmittel 29 4.2.2 Verbrauchsmaterialien 30 4.2.3 Molekulare Diagnostiksysteme 31 4.2.4 Primer für PCR und Sequenzierung 31 4.2.5 Medien und Lösungen 31 4.3 Mikrobiologische Methoden 32 4.3.1 Mikrobiologische Proben 32 4.3.2 Kultur von GAS 32 4.3.3 Latex-Agglutinationstest auf Gruppe A Antigen 33 4.3.4 Kryokonservierung der Isolate 34 4.4 Molekulargenetische Methoden 35 4.4.1 DNA-Isolierung 35 4.4.2 Photometrische Bestimmung der DNS-Konzentration und Einstellung 36 4.4.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 37 4.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 37 4.4.5 DNA Sequenzierung 39 4.4.6 Sequenz-basierte Typisierung 41 4.5 Statistische Auswertung 42 5 Ergebnisse 43 5.1 Ausgewertete mikrobiologische Proben und retrospektive Daten 43 5.2 Analyse der Kohorte 45 5.2.1 Analyse der Altersverteilung 45 5.2.2 Analyse der Geschlechtsverteilung 48 5.2.3 Analyse der saisonalen Verteilung 49 5.2.4 Analyse der klinischen Symptome 51 5.2.5 Analyse von Vorerkrankungen und Versorgungsform 55 5.3 Laborbefunde 58 5.3.1 Analyse der semiquantitativen Wachstumsdichte der Abstrich-Kulturen 58 5.3.2 Blutparameter: C-Reaktives Protein (CRP) 59 5.3.3 Blutparameter: Leukozytenzahl 59 5.4 Molekulare Epidemiologie des emm-Typs 60 5.5 Erstbeschreibung neuer emm-Subtypen 60 5.6 emm-Typ- bzw. Cluster-Verteilung und klinische Manifestation 61 5.6.1 emm-Verteilung bei Tonsillopharyngitis 61 5.6.2 emm-Verteilung bei akuter Otitis media (AOM) 63 5.6.3 emm-Verteilung bei Hautinfektionen 64 5.6.4 emm-Verteilung bei anogenitalen Infektionen 65 5.6.5 emm-Verteilung bei invasiven Infektionen 68 5.6.6 emm-Verteilung bei asymptomatischer Rachen-Kolonisierung 68 5.7 Analyse der Altersverteilung für emm-Typen und -Cluster 70 5.8 Infektionsparameter und Korrelation zur molekularen Epidemiologie 71 5.8.1 Temperatur: 71 5.8.2 CRP: 72 5.8.3 Leukozytenzahl: 73 5.9 Patienten mit wiederholten Vorstellungen 73 5.9.1 Antibiotische Therapie 75 5.10 Resistenzlage 76 5.11 Analyse der molekularen Epidemiologie über der Zeit 78 6 Diskussion 80 6.1 Vorbemerkung 80 6.2 Kohorte 81 6.2.1 Alter 81 6.2.2 Geschlecht 82 6.2.3 Jahreszeit 82 6.2.4 Vorerkrankungen 83 6.2.5 Klinische Symptome 84 6.2.6 Diagnostischer Wert der semiquantitativen Wachstumsdichte 85 6.2.7 Rezidive 85 6.3 emm-Typ und –Cluster-Epidemiologie 86 6.3.1 emm-Typen und -Cluster bei Tonsillopharyngitis 86 6.3.2 emm-Typen und –Cluster bei Anogenitalinfektionen 86 6.3.3 emm-Typen und -Cluster bei invasiven Infektionen 87 6.3.4 emm-Typ und -Cluster-Epidemiologie im Vergleich zu anderen Studien 87 6.3.5 Longitudinale Betrachtung der emm-Typ-Epidemiologie 91 6.3.6 Vergleich der emm-Typen und Cluster-hinsichtlich des Alters der Patienten 92 6.3.7 emm-Typen und -Cluster hinsichtlich Infektionsparametern 92 6.3.8 Deckungsgrad mit 30-valentem M-Protein-basiertem GAS-Impfstoff 95 6.3.9 emm-Typ / -Cluster – Antibiotika-Resistenz 96 6.4 Ausblick 97 7 Zusammenfassung 98 8 Summary 101 9 Anhang 104 10 Abbildungsverzeichnis 112 11 Tabellenverzeichnis 114 12 Abkürzungsverzeichnis 116 13 Literaturverzeichnis 118 14 Anlage 1 127 15 Anlage 2 129 16 Danksagung 131Although - since the introduction of penicillin - there has been an effective drug against strep-tococci of Lancefield Group A (GAS), in which no resistance has been described so far, GAS infections remain a major healthcare policy problem, which affects both morbidity and mortality of people worldwide. GAS can cause a wide range of disorders in humans. These include un-complicated pharyngeal infections with and without scarlet fever as well as skin infections such as erysipelas or impetigo but also invasive as well as secondary complications. In 1928, the M-protein encoded by the emm gene was described as a type-specific, antibody -inducing substance and has since been used to characterize the epidemiology of GAS. One of the main functions of the M protein, anchored on the surface of GAS, is to evade phagocytosis by polymorphonuclear leukocytes, which is one of the most important defense mechanisms against infections by GAS. Although major efforts have been made for several decades, a safe and effective vaccine remains an unreached goal. In this study, the regional epidemiology of infections of pediatric patients by GAS was retro-spectively investigated on the basis of data and isolates collected from 11.03.2006 to 19.05.2012 at the University Medical Center in Freiburg. With a total of 566 isolates and asso-ciated clinical data, the present study provides the largest uni-centric epidemiological study of pediatric diseases with emm-typing of GAS so far in Germany. Particular attention was paid to associations between molecular epidemiology, based on emm-typing, and anonymized clinical data. The total cohort included 566 cases, thereof 405 cases of pharyngeal infection, 75 of which were additionally diagnosed with scarlet fever, 34 children presented with a skin infection, 21 with an acute otitis media, 19 with an anogenital infection, eight with an invasive infection and two with an urinary tract infection. In 77 cases colonization by GAS was estimated as having no clinical relevance of those 48 isolates were isolated from pharyngeal swabs. In the molecular investigation, three new emm subtypes were discovered which were first de-scribed as emm29.13, emm36.7 as well as emm75.5. These sequences were entered into the database of the CDC. Over the entire cohort, emm12 was found in 19% of all cases and was thus the most frequent, followed by emm1 and emm4, with 14% each, emm28 and emm89, with 11% each. When considering emm-clusters, E4 was the most frequent with 31%, followed by cluster A-C4 with 19%, A-C3 and E1 with 14%. Among the 405 cases with GAS-related pharyngeal infection, emm12 was the most common with almost 20%, followed by emm4 with 15%, emm1 with 14%, emm89 with 13% and emm28 as well as emm3 with 9% each. With respect to the clus-ters, E4 was found to be the most common with around 30%, followed by A-C4 with 20%, E1 with 15% and A-C3 with 14%. In the present study it was shown that emm-types as well as emm-clusters differed depending on the clinical manifestation. Although the distributions were basically similar, emm4 as well as clusters A-C5 and E1 were significantly more common in patients with tonsillopharyngitis and scarlet fever, even after Bonferroni correction, than those with tonsillopharyngitis but without the diagnosis of scarlet fever. These findings were first described in a preliminary evaluation of this cohort in 2013 and supported by the results of consecutively published international stud-ies. In anogenital infections, cluster E4 was found in almost 80% and emm28 in 58%, indicat-ing a clearly narrowed spectrum. Compared to cases with tonsillopharygitis, emm28 and clus-ter E4 were significantly more frequently isolated in anogenital infections. For skin infections no significant difference could be found in the emm-distribution compared to tonsillopharyngi-tis. However, cluster E4 was found to be significantly more common in patients with a skin infection than in those with scarlet fever. Overall, in a direct comparison to a French study, there was a wide agreement regarding the epidemiology of emm-types and -clusters, but also some differences. These differences were significant for emm6, emm22, as well as for cluster M6. Furthermore, among others, the study by d´Humieres et al. confirmed the accumulation of emm4 in scarlet fever patients, which un-derlines the statement of the presented results. Furthermore, in order to investigate the longitudinal development of emm-types and emm-clusters, the distribution in the period from 01.04.2006 to 31.03.2007 was compared to that from 01.05.2011 to 30.04.2012. At least for the comparatively short period, no significant changes in the epidemiology of individual emm-types or -clusters could have been observed after adjusting the p-values. In previous studies, the pathogenicity of a strain was determined by its association to the clini-cal picture. In addition, this study investigated the extent to which individual emm-types or emm-clusters also differed in quantitatively measurable parameters such as the C-reactive protein (CRP) and the leukocyte count in the blood. In cases of tonsillopharyngitis, cluster E4 was found significantly associated with a CRP value above 35 mg/l. For the leukocyte count such a difference was not detectable. However, since the values were subject to confounding factors, a causal link between pathogenicity of certain emm-types and the deflection of the mentioned parameters could not be proved within the framework of this study. Therefore, these results do not allow to draw final conclusions. The existing 30-valent M-protein based vaccine would show a good agreement with the corre-sponding emm-types of the cohort used here. The antigens of 19 of the 25 different emm-types registered in this study were included in the vaccination model, which corresponds to a vaccine coverage of 99.8% (565 of 566) of all strains examined here, if cross-reactivity of GAS strains within an emm-cluster was taken into consideration. Overall, the uni-centric character of the study presented here provided in certain aspects an advantage over multi-centric studies, as differences and similarities between different clinical pictures, excluding regional differences as well as comprehensive clinical information on the cases, could be emphasized. The extent to which regional prevalence of individual emm-types or their pathogenicity potential are decisive for the epidemiology of invasive infections could not be conclusively assessed by this study. For a closer look at this issue, further studies on a larger scale would be necessary. In summary, this work presents a comprehensive epidemiological investigation on molecular epidemiologic pathogen analysis including clinical aspects in a large pediatric cohort. The find-ings contribute to the elucidation of the regional an international epidemiology of GAS and pro-vide important basics as well as approaches for subsequent investigations, especially for vac-cine development against GAS.:1 Einleitung 7 2 Theoretische Grundlagen 8 2.1 Epidemiologie 8 2.2 Taxonomie 10 2.3 Infektionspathologie 11 2.4 Aufbau des M-Proteins 14 2.5 Die Bedeutung des M-Proteins 16 2.6 emm-Genetik 18 2.7 Therapie und Prophylaxe 20 3 Ziele der Studie 22 4 Patienten, Material und Methoden 23 4.1 Mikrobiologische Isolate und klinische Daten 23 4.1.1 „Klinische Krankheitsbilder“ 25 4.1.2 Modifizierter Centor-Score 26 4.1.3 Grunderkrankungen 27 4.1.4 Paraklinik 27 4.2 Geräte und Materialien 29 4.2.1 Geräte und Hilfsmittel 29 4.2.2 Verbrauchsmaterialien 30 4.2.3 Molekulare Diagnostiksysteme 31 4.2.4 Primer für PCR und Sequenzierung 31 4.2.5 Medien und Lösungen 31 4.3 Mikrobiologische Methoden 32 4.3.1 Mikrobiologische Proben 32 4.3.2 Kultur von GAS 32 4.3.3 Latex-Agglutinationstest auf Gruppe A Antigen 33 4.3.4 Kryokonservierung der Isolate 34 4.4 Molekulargenetische Methoden 35 4.4.1 DNA-Isolierung 35 4.4.2 Photometrische Bestimmung der DNS-Konzentration und Einstellung 36 4.4.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 37 4.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 37 4.4.5 DNA Sequenzierung 39 4.4.6 Sequenz-basierte Typisierung 41 4.5 Statistische Auswertung 42 5 Ergebnisse 43 5.1 Ausgewertete mikrobiologische Proben und retrospektive Daten 43 5.2 Analyse der Kohorte 45 5.2.1 Analyse der Altersverteilung 45 5.2.2 Analyse der Geschlechtsverteilung 48 5.2.3 Analyse der saisonalen Verteilung 49 5.2.4 Analyse der klinischen Symptome 51 5.2.5 Analyse von Vorerkrankungen und Versorgungsform 55 5.3 Laborbefunde 58 5.3.1 Analyse der semiquantitativen Wachstumsdichte der Abstrich-Kulturen 58 5.3.2 Blutparameter: C-Reaktives Protein (CRP) 59 5.3.3 Blutparameter: Leukozytenzahl 59 5.4 Molekulare Epidemiologie des emm-Typs 60 5.5 Erstbeschreibung neuer emm-Subtypen 60 5.6 emm-Typ- bzw. Cluster-Verteilung und klinische Manifestation 61 5.6.1 emm-Verteilung bei Tonsillopharyngitis 61 5.6.2 emm-Verteilung bei akuter Otitis media (AOM) 63 5.6.3 emm-Verteilung bei Hautinfektionen 64 5.6.4 emm-Verteilung bei anogenitalen Infektionen 65 5.6.5 emm-Verteilung bei invasiven Infektionen 68 5.6.6 emm-Verteilung bei asymptomatischer Rachen-Kolonisierung 68 5.7 Analyse der Altersverteilung für emm-Typen und -Cluster 70 5.8 Infektionsparameter und Korrelation zur molekularen Epidemiologie 71 5.8.1 Temperatur: 71 5.8.2 CRP: 72 5.8.3 Leukozytenzahl: 73 5.9 Patienten mit wiederholten Vorstellungen 73 5.9.1 Antibiotische Therapie 75 5.10 Resistenzlage 76 5.11 Analyse der molekularen Epidemiologie über der Zeit 78 6 Diskussion 80 6.1 Vorbemerkung 80 6.2 Kohorte 81 6.2.1 Alter 81 6.2.2 Geschlecht 82 6.2.3 Jahreszeit 82 6.2.4 Vorerkrankungen 83 6.2.5 Klinische Symptome 84 6.2.6 Diagnostischer Wert der semiquantitativen Wachstumsdichte 85 6.2.7 Rezidive 85 6.3 emm-Typ und –Cluster-Epidemiologie 86 6.3.1 emm-Typen und -Cluster bei Tonsillopharyngitis 86 6.3.2 emm-Typen und –Cluster bei Anogenitalinfektionen 86 6.3.3 emm-Typen und -Cluster bei invasiven Infektionen 87 6.3.4 emm-Typ und -Cluster-Epidemiologie im Vergleich zu anderen Studien 87 6.3.5 Longitudinale Betrachtung der emm-Typ-Epidemiologie 91 6.3.6 Vergleich der emm-Typen und Cluster-hinsichtlich des Alters der Patienten 92 6.3.7 emm-Typen und -Cluster hinsichtlich Infektionsparametern 92 6.3.8 Deckungsgrad mit 30-valentem M-Protein-basiertem GAS-Impfstoff 95 6.3.9 emm-Typ / -Cluster – Antibiotika-Resistenz 96 6.4 Ausblick 97 7 Zusammenfassung 98 8 Summary 101 9 Anhang 104 10 Abbildungsverzeichnis 112 11 Tabellenverzeichnis 114 12 Abkürzungsverzeichnis 116 13 Literaturverzeichnis 118 14 Anlage 1 127 15 Anlage 2 129 16 Danksagu