INVESTIGATION OF MITOCHONDRIAL DYSFUNCTION ON GESTATIONAL DIABETES

Amaç: Çalışmada ilk olarak gestasyonel diyabetli (GDM) kadınların plasentalarında, füzyon belirteçlerinin ve mitokondriyal katlanmamış protein cevabından (mtUPR) sorumlu belirteçlerin ekspresyonlarının, sağlıklı plasentalar (kontrol) ve doğumdan önce diyabete sahip (Pre-DM) kadınların plasentaları ile karşılaştırılması amaçlandı. Daha sonra yüksek glukoz ortamındaki plasenta trofoblast hücrelerinde fisyonun kimyasal olarak inhibisyonunun, mitokondri fonksiyonlarına, apoptoza, otofajiye, inflamazom ekspresyonlarına ve insülin sinyallemesi üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: İlk aşamada, kontrol (n=17), GDM (n=20) ve Pre-DM (n=10) gruplarındaki plasentalarda füzyon dinamikleri ve mitokondriyal biyogenezde görevli mRNA ekspresyonları qPCR ile karşılaştırıldı. Sonra bu gruplarda vücut kitle indekslerine göre bir alt gruplandırma yapılarak gruplar “obez ve zayıf” olarak tekrar ayrıldı. Bu gruplarda yine füzyon dinamikleri ve mitokondriyal biyogenezde görevli mRNA ekspresyonları qPCR ile saptandı. Ardından füzyon belirteçleri ile mtUPR’ de görevli protein ekspresyonları western blot ile tespit edildi. İkinci aşamada trofoblast hücreleri normal (5mM) ve yüksek glukoz (25mM) ortamında 24 saat ve 48 saat kültüre edildi. Bu uygulamada hücrelerdeki fisyon ve füzyon belirteçleri western blot ile saptandı. Ardından hücrelere fisyon inhibitörleri mdivi-1, dynasore ve P-110 iki farklı dozda uygulanarak fisyonun inhibe edilmesi sağlandı. Fisyon inhibisyonuyla birlikte insülin sinyali ve otofaji yolunda görülen değişiklikler western blot ile saptandı. Daha sonra qPCR ile füzyon belirteçleri, mitokondriyal antioksidan enzim kapasiteleri, otofajide, apoptozda ve mtUPR’ de görevli mRNA ekspresyonları ile inflamazom mRNA ekspresyonları tespit edildi. Akabinde hücrelere canlılık testi uygulandı. Son olarak akış sitometrisiyle mitokondri potansiyeli ve hücredeki reaktif oksijen türevleri (ROS) durumları belirlendi. Bulgular: İlk kısımda GDM ve Pre-DM gruplarında kontrol grubuna kıyasla füzyon belirteçlerinde anlamlı bir azalma tespit edildi. Obez ve zayıf olarak ayrılan alt gruplarda obezitenin füzyon üzerine etkisi vardı. Fakat hastalar obez olsun ya da olmasın diyabet, mitokondri füzyonunun, mitokondri biyogenezinin ve mtUPR cevabının azalmasına neden oldu. İkinci kısımda yüksek glukoz ortamında trofoblast hücrelerinde fisyon anlamlı olarak artarken füzyon azaldı. Bu artış inhibitörlerle bloke edildiğinde insülin sinyalinde bir düzelme saptandı. Ayrıca mitokondriyal fisyonun engellenmesi ROS’ un anlamlı derecede azalmasını ve mitokondriyal antioksidan enzim mRNA ekspresyonlarının artmasını sağladı. mtUPR’ de görevli protein ekspresyonları fisyonun inhibe edilmesine yanıt olarak anlamlı derecede azaldı. Dahası fisyon inbisiyonu hücrelerde apoptozun önüne geçilmesine katkıda bulunurken, inflamazom mRNA ekspresyonlarını anlamlı derecede azalttı. Son olarak yüksek glukoz nedeniyle düşen mitokondri potansiyeli, fisyonun inhibisyonuyla anlamlı derecede arttı. Sonuç: GDM ve Pre-DM plasentada mitokondri füzyonunda ve biyogenezinde bir azalmaya yol açmaktadır. Obezite bu azalmaya katkıda bulunurken diyabet etkeni bu azalmanın ana nedenidir. Benzer şekilde füzyon ve mtUPR protein seviyeleri GDM ve Pre-DM plasentalarında azalmıştır. Trofoblast hücrelerinde fisyonun inhibe edilmesini sağlayan kimyasallar, hamilelikte görülen diyabet tablolarında potansiyel terapötikler olarak; başta mitokondri fonksiyonunda iyileşmeye olanak sağlamış, insülin sinyalini düzenlemiş, apoptozun, otofajinin ve inflamazom ekspresyonlarının önüne geçilmesini sağlamıştır.KABUL VE ONAY i TEŞEKKÜR ii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ vii ŞEKİLLER DİZİNİ xi RESİMLER DİZİNİ xiv TABLOLAR DİZİNİ xv ÖZET xvii ABSTRACT xix 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Diabetes Mellitus 4 2.2. Diyabetin Sınıflandırılması 5 2.2.1. Gestasyonel Diyabet 7 2.2.1.1. GDM’ nin Patofizyolojisi 9 2.2.1.1.1. Maternal İnsülin Direnci 9 2.2.1.1.2. İnflamasyon 11 2.2.1.1.3. Plasental Disfonksiyon 12 2.2.1.1.4. Endoteliyal Hücre Disfonksiyonu 14 2.2.1.2. GDM’ de Bozulan Moleküler Yolaklar 15 2.3. Mitokondri Yapısı ve Fonksiyonu 20 2.4. Plasenta ve Trofoblast Mitokondriyal Fonksiyonu 21 2.5. Mitokondriyal Hasar Sinyalleri 24 2.5.1. Mitokondri ve Oksidatif Stres 24 2.5.2. Mitokondri ve Apoptoz 26 2.5.3. Mitokondriyal Biyogenez 27 2.5.4. Mitokondriyal Katlanmamış Protein Yanıtı (mtUPR) 28 2.5.5. Mitofaji 29 2.5.6. Mitokondriyal Dinamikler 31 2.5.6.1. Mitokondriyal Dinamiklerin Hedeflenmesi “Fisyon İnhibitörleri” 34 3.1. Gereç 37 3.1.1. Cihazlar 37 3.1.2. Kimyasal Maddeler, Primerler ve Antikorlar 38 3.2. Yöntem 41 3.2.1. Hasta Seçimi ve Plasenta Dokularının Toplanması 41 3.2.2. Hücre Kültürü ve İnhibitörlerin Uygulanması 42 3.2.2.1. Hücre Kültürü Optimizasyonu 42 3.2.2.2. İnhibitörlerin Uygulanması 44 3.2.3. Metiltiazol Difenil Tetrazolyum (MTT) Testi 45 3.2.4. Protein İzolasyonu 46 3.2.4.1. Dokulardan Protein İzolasyonu 46 3.2.4.2. Hücrelerden Protein İzolasyonu 47 3.2.5. Protein Miktarı Tayini 48 3.2.6. Western Blot 49 3.2.7. RNA İzolasyonu 51 3.2.8. Komplementer DNA (cDNA) Sentezi 52 3.2.9. Real Time PCR 53 3.2.10. Mitokondriyal Potansiyelin Belirlenmesi 54 3.2.11. Oksidatif Stresin Belirlenmesi 56 3.2.12. İstatistiksel Analizler 57 4. BULGULAR 58 4.1. Hasta Karakteristik Özellikleri ve Biyokimyasal Değerlendirmeler 58 4.1.2. Hastaların Karaciğer Enzim Seviyeleri 65 4.2. Plasenta Dokusu mRNA Ekspresyonları 67 4.2.1. Kombine Gruplarda mRNA Ekspresyonları 67 4.2.2. Alt Gruplarda mRNA Ekspresyonları 71 4.3. Plasenta Dokusu Protein Ekspresyonları 76 4.4. Trofoblast Hücrelerinde Protein Ekspresyonları 80 4.4.1. Yüksek Glukoz Uygulamasının Füzyon ve Fisyon Proteinlerine Etkisi 80 4.4.2. Fisyon İnhibitörlerinin Fisyon Proteinlerine Etkisi 83 4.4.3. Fisyon İnhibitörlerinin İnsülin Sinyal Proteinlerine Etkisi 86 4.4.4. Fisyon İnhibitörlerinin Otofaji Proteinlerine Etkisi 95 4.5. Trofoblast Hücrelerinde mRNA Ekspresyonları 98 4.5.1. Fisyon İnhibitörlerinin Füzyon Belirteçleri mRNA Ekspresyonlarına Etkisi 99 4.5.2. Fisyon İnhibitörlerinin mtUPR Belirteçleri mRNA Ekspresyonlarına Etkisi 102 4.5.3. Fisyon İnhibitörlerinin Mitokondriyal Antioksidan Enzim mRNA Ekspresyonlarına Etkisi 105 4.5.4. Fisyon İnhibitörlerinin Apoptoz Belirteçleri mRNA Ekspresyonlarına Etkisi 107 4.5.5. Fisyon İnhibitörlerinin Beclin1 mRNA Ekspresyonuna Etkisi 109 4.5.6. Fisyon İnhibitörlerinin Nlrp3 İnflamazom mRNA Ekspresyonuna Etkisi 111 4.6. Fisyon İnhibitörlerinin Hücre Canlılığına Etkisi 112 4.7. Fisyon İnhibitörlerinin Mitokondri Potansiyeline Etkisi 113 4.8. Fisyon İnhibitörlerinin Oksidatif Stres Üzerine Etkisi 115 5. TARTIŞMA 118 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 129 KAYNAKLAR 131 EKLER 163 Ek 1. Etik Kurul Onay Belgesi 163 BİLİMSEL ETİK BEYANI 164 ÖZ GEÇMİŞ 16