Estudo das propriedades bioquímicas e farmacológicas da peçonha de Rhopalurus agamemnon

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2021.As peçonhas de escorpião são formadas por toxinas prejudiciais a vários organismos, incluindo humanos. Várias técnicas foram desenvolvidas para entender o papel das proteínas na peçonha de animais, incluindo abordagem proteômica. Rhopalurus agamemnon (Koch, 1839) é o maior escorpião da família Buthidae no Cerrado brasileiro, medindo até 110 mm de comprimento total. O acidente com R. agamemnon é doloroso e causa algumas reações sistêmicas, mas a peçonha da espécie permanece sem investigação. Exploramos a composição protéica da peçonha por abordagem proteômica, transcriptômica e atividade-específica, identificando centenas de proteínas, incluindo enzimas como a hialuronidase, metaloproteinase, L-aminoácido oxidase e amilase, as duas últimas são relatadas pela primeira vez para peçonhas de escorpião. Esses relatos inéditos são importantes para demonstrar o quão distantes estamos de uma compreensão total da diversidade das peçonhas em em composição e função. Além disso, sabe-se que peçonhas escorpiônicas são compostas majoritariamente de moduladores de canais iônicos como sódio, potássio, cálcio e cloreto. Os moduladores iônicos são conhecidos pelo efeito neurotóxico da peçonha e pelo efeito nociceptivo do envenenamento. No entanto os moduladores de canais iônicos têm mostrado potencial efeito antitumoral contra diversas linhagens de câncer de próstata, mama e gliomas. No presente trabalho foi isolada e caracterizada uma proteína de 7118 Da com atividade sobre canais de sódio NaV 1.4 e 1.5 e atividade antitumoral específica para câncer de mama, com efeito sobre as linhagens MCF7 e MDA MB 231, provocando apoptose como demonstrado por citometria de fluxo. A toxina denominada Ra32 foi sequenciada por espectrometria de massa, sua estrutura secundária avaliada por dicroísmo circular, além da predição in silico. A estrutura primária da Ra32 é semelhante a β-NaTx Css9 de Centruroides suffusus, que deslocam a voltagem de ativação para potenciais mais negativos, afetando assim a ativação do canal de sódio e promovendo disparos espontâneos e repetitivos. Além da toxina nativa, a toxina recombinante foi expressa em E. coli com uma modificação na região C terminal, para comparação dos efeitos. A toxina nativa se mostrou mais potente contra as duas linhagens de câncer de mama testadas. A toxina nativa parece induzir apoptose pelo bloqueio dos canais NaV 1.4 e 1.5, contudo mais estudos precisam ser realizados para confirmar o mecanismo de ação da toxina. Esses dados destacam a diversidade única das proteínas da peçonha do escorpião R. agamemnon, fornecem ideias sobre novos mecanismos de envenenamento e ampliam o banco de dados de proteínas de peçonhas escorpiônicas. Os nossos dados podem ser importantes para compreender o mecanismo de ação de toxinas moduladoras de canais iônicos sobre células tumorais, além de aumentarem as possibilidades de aplicação biotecnológica destas toxinas. A descoberta de novas proteínas proporciona um novo cenário para o desenvolvimento de novas drogas e sugere novos alvos moleculares para componentes da peçonha.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Scorpion venoms are formed by toxins harmful to various organisms including humans. Several techniques have been developed to understand the role of proteins in animal venoms, including a proteomic approach. Rhopalurus agamemnon (Koch, 1839) is the largest scorpion of the Buthidae family living in Brazilian Cerrado, measuring up to 110 mm in total length. The accident with R. agamemnon is painful and causes some systemic reactions, but the venom of the species remains without investigation. We explored the protein composition of the venom using a proteomic, transcriptomic and activity- specific approach, identifying hundreds of proteins, including enzymes such as hyaluronidase, metalloproteinase, L-amino acid oxidase, and amylase, the last two being reported for the first time for scorpion venoms. These unprecedented reports are important to demonstrate how far away we are from a total understanding of the venoms’ diversity in composition and function. In addition, it is known that scorpion venoms are mainly composed of sodium, potassium, calcium and chloride ion channel modulators. Ionic modulators are known for the venom's neurotoxic effect and the nociceptive effect of poisoning. However, ion channel modulators have shown a potential antitumor effect against several strains of prostate, breast and gliomas cancer cells. In the present work, a 7118 Da protein with activity on hNaV 1.4 and 1.5 sodium channels and specific anti-tumor activity for breast cancer towards MCF7 and MDA MB 231 cell lines was isolated and characterized., causing apoptosis as demonstrated by flow cytometry. . The toxin called Ra32 was sequenced by mass spectrometry, its secondary structure evaluated by circular dichroism, in addition to in silico prediction. The primary structure of Ra32 is similar to Centruroides suffusus β-NaTx Css9, which shifts the activation voltage to more negative potentials, thus affecting the activation of the sodium channel and promoting spontaneous and repetitive firing. In addition to the native toxin, the recombinant toxin displaying a C-terminal region modification was expressed in E. coli to compare their activities. The native toxin proved to be more potent against the two breast cancer strains tested. The native toxin appears to induce apoptosis by blocking the NaV 1.4 and 1.5 channels, however further studies need to be carried out to confirm the toxin's mechanism of action. These data highlight the unique diversity of R. agamemnon venom proteins, provide insights into new poisoning mechanisms, and expand the scorpion venom protein database. Our data may be important to understand the mechanism of action of ion channel modulating toxins on tumoral cells, in addition to increasing the possibilities of biotechnological application of these toxins. The discovery of new proteins provides a new scenario for the development of new drugs and suggests new molecular targets for venom components