Redução do Teor de Ácido Fítico em Sementes de Soja Mediado por CRISPR e na RNA Interferente

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2021.A maior parte do fósforo encontrado nas sementes de soja está acumulada na forma de ácido fítico, representando mais de 85% do fósforo total. Sua biossíntese ocorre através da via do inositol-fosfato. Quando esta molécula está na forma de sal, fitato, é considerado um fator antinutricional, pois limita a disponibilidade de alguns nutrientes essenciais, diminuindo o valor nutricional das ementes. Além disso, o ácido fítico não é digerível pelos monogástricos, sendo amplamente excretado em vez de absorvido, podendo resultar no acúmulo de fósforo nos solos, causando também poluição das águas. De modo que o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma linhagem de soja com reduzido teor de ácido fítico, por meio da engenharia genética. Para isso, foram utilizadas duas metodologias, CRISPR e RNA interferente. Inicialmente duas configurações do sistema CRISPR foram avaliadas por hairy-root. (1) Um cassete simplificado (STU) onde tanto a Cas9 quanto os RNA guias (sgRNA) são controlados por um mesmo promotor, versus (2) um cassete tradicional (TCTU), mais comumente utilizado, onde a Cas9 está sob a regulação de um promotor e cada sgRNA por outro promotor (TCTU). O sistema STU aqui utilizado, permitiu uma redução de mais de 1.000pb no tamanho dos vetores de transformação. Foram escolhidos dois genes que atuam ao final da via de biossíntese do ácido fítico, GmIPK1 e GmIPK2. Os resultados indicaram que o sistema tradicional se apresentou mais eficiente em gerar edições no genoma das raízes de soja, embora os dois sistemas tenham demonstrado funcionalidade. O cassete TCTU foi então escolhido para gerar os transformantes definitivos de soja via sistema biobalístico de transformação. Plantas com edição em ambos os genes (GmIPK1 e GmIPK2) foram geradas individualmente, e o conteúdo de ácido fítico foram avaliados, destacando assim 3 eventos: IPK1-5D2 (11,56%) IPK2-24B2 (14,11%) IPK2-24C4 (25,35%) que apresentaram uma aparente redução de ácido fítico sem alteração nas características agronômicas. Também foram geradas plantas de soja transformadas utilizando a técnica de RNA interferente para redução da expressão do gene GmIPK2. Análises da quantidade de ácido fítico foram avaliadas nas plantas geradas destacando 3 eventos IPK2- RNAi_1A1 (23,96%) IPK2-RNAi_1D2 (41,67%) e IPK2-RNAi_7C2 (13,71%) com aparente redução. Foi observado alterações no fenótipo da linhagem 1D2 com retardo no desenvolvimento e baixa produtividade. No entanto a linhagem 1A1 se mostrou um potencial candidato, visto ter apresentado redução de ácido fítico sem alterações fenotípicas. A utilização de ambas as metodologias (CRISPR e RNAi), foram eficazes na geração de plantas de soja com redução no conteúdo de ácido fítico em sementes. No entanto novos experimentos ainda são necessários para compreender a natureza das mutações para os eventos CRISPRs além de avaliar a biodisponibilidade de nutrientes nas sementes após a redução do ácido fítico em todos os eventos com destaque gerados nesse trabalho.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Most of the phosphorus found in soybean seeds is accumulated in the form of phytic acid, representing more than 85% of the total phosphorus. Its biosynthesis occurs by the inositol- phosphate pathway. When this molecule is in the salt form, phytate, it is considered an anti- nutritional factor, as it limits the availability of some essential nutrients and decreases the nutritional value of the seeds. In addition, phytic acid is not digestible by monogastrics, being largely excreted rather than absorbed, which can result in the accumulation of phosphorus in soils, also causing water pollution. So, the objective of this work was to develop a soybean event with reduced phytic acid content, through genetic engineering. CRISPR and RNA interference were used. Initially, two configurations of the CRISPR system were evaluated by hairy-root. (1) A simplified cassette (STU) where both Cas9 and guide RNA (sgRNA) are controlled by the same promoter versus (2) a traditional cassette (TCTU) traditional cassette, most commonly used, where Cas9 is under the regulation of a promoter and each sgRNA by another promoter. The STU system allowed a reduction of more than 1,000bp in the size of the transformation vectors. Two target genes that act at the end of the phytic acid biosynthesis pathway, namely GmIPK1 and GmIPK2 were chosen. The results indicated that the traditional system was more efficient in generating genome edits in soybean roots, although both systems demonstrated functionality. The TCTU cassette was then chosen to generate the definitive soybean events using a biolistic transformation system. Plants edited in both genes (GmIPK1 and GmIPK2) were generated individually, and the phytic acid content was evaluated, thus highlighting 3 events: IPK1-5D2 (11.56%) IPK2-24B2 (14.11%) IPK2- 24C4 (25.35%) that showed an apparent reduction of phytic acid without change in agronomic characteristics. Transformed soybean plants were also generated using the interfering RNA technique to reduce the expression of the GmIPK2 gene. Analyzes of the amount of phytic acid were evaluated in the generated plants highlighting 3 events IPK2-RNAi_1A1 (23.96%) IPK2-RNAi_1D2 (41.67%) and IPK2-RNAi_7C2 (13.71%) with apparent reduction. Changes in the phenotype of the 1D2 strain were observed with developmental delay and low productivity. However, the 1A1 strain proved to be a potential candidate, as it showed a reduction in phytic acid without phenotypic changes. The use of both methodologies (CRISPR and RNAi) was effective in generating soybean plants with reduced phytic acid content in seeds. However, new experiments are still needed to understand the nature of mutations for CRISPRs events, in addition to evaluating the bioavailability of nutrients in seeds after phytic acid reduction in all prominent events generated in this work