Estudio de calidad ambiental con larvas de anfibios como bioindicadores

Las actividades antrópicas generan presiones ambientales que en muchos casos superan la capacidad de depuración, adaptación y regulación de los patrones normales de estabilidad que poseen los ecosistemas, poniendo en riesgo su integridad y la calidad del ambiente. Este trabajo de tesis doctoral en su concepción y desarrollo se ubica en el seno de la Ecotoxicología, una disciplina científica emergente que provee estrategias de evaluación y diagnóstico de los efectos de la contaminación sobre los ecosistemas y los elementos que los componen. Considerando por un lado, que los anfibios poseen ciertas características biológicas que los disponen como especies indicadoras, útiles para medir efectos causados por cambios locales en el ambiente, y que la ocurrencia de anormalidades morfológicas en individuos presenta relevancia biológica, se planteó desarrollar, a partir del estudio detallado de la presencia de anormalidades y alteraciones en los patrones normales del desarrollo de larvas de dos especies autóctonas (Boana pulchella y Rhinella arenarum), valores de referencia que permitan utilizar la ocurrencia de diferentes tipos de anormalidades y su frecuencia de aparición como biomarcadores (puntos finales de evaluación ecotoxicológicos), y a su vez utilizar a los anuros como bioindicadores de calidad ambiental para finalmente promover su empleo e incorporación en estrategias de diagnóstico ambiental. El desarrollo del plan de trabajo se presenta en 4 capítulos en los que se abordan de manera detallada los objetivos específicos. Estos siguen un orden que refleja el avance en la investigación y hacia el final se integran los resultados en virtud de alcanzar el objetivo general. En el primer capítulo se presenta una descripción del área de estudio, la cual se ubica en la Ciudad de La Plata y alrededores. Dentro del área de estudio se identificaron 4 problemáticas ambientales evidentes: Agricultura, Urbanismo, Industrialización y Descargas cloacales. Además, se seleccionó un área como zona de referencia, con características ambientales similares, pero sin influencia directa de estas actividades antrópicas. Dentro de estas zonas se seleccionaron un total de 28 sitios de estudio, los que cumplieron con ciertos criterios de accesibilidad, influencia de actividades antrópicas e indicios evidentes de contaminación. En cada sitio se realizó una caracterización fisicoquímica de la calidad del agua y sedimentos. Complementariamente, se realizó una revisión exhaustiva de trabajos científicos publicados que presentaran información de la presencia de contaminantes en las zonas de estudio. La interpretación conjunta de los resultados obtenidos y de la información proveniente de las publicaciones existentes permitió caracterizar los sitios de estudio en relación con las problemáticas que los afectan. A partir de datos cedidos por el Servicio Meteorológico Nacional se realizó una caracterización climática del periodo estudiado (2015-2018) y una comparación con el comportamiento normal esperado según los datos del periodo 1981- 2010. Las fluctuaciones en las variables ambientales registradas se asociaron con la actividad reproductiva de las especies estudiadas, y permitieron explicar eventos particulares. Los relevamientos de las especies de anuros, siguiendo métodos normalizados, permitieron determinar la riqueza de especies en cada sitio. En los sitios de referencia se hallaron un total de 13 especies (entre ellas las dos especies seleccionadas), en el resto de los sitios la riqueza específica fue menor. Los resultados obtenidos permitieron distinguir a las especies, Scinax squalirostris; Scinax granulatus; Odontophrynus americanus; Ceratophrys ornata; Leptodactylus gracilis como candidatos para ser utilizados como indicadores. Para una de las especies seleccionadas (Boana pulchella), y con la intención de lograr la reproducción en cautiverio, se realizaron estudios detallados de aspectos reproductivos. A saber, se realizaron monitoreos en sitios de referencia obteniéndose datos morfométricos de hembras y machos en diferentes etapas del ciclo reproductivo, lo que permitió determinar el estado óptimo para la reproducción. Los individuos colectados fueron utilizados para la inducción artificial de la reproducción mediante el método AMPHIPLEX en reiteradas oportunidades. El método resultó exitoso en dos ocasiones y en la totalidad de las inducciones se evidenciaron respuestas a nivel reproductivo: emisión de canto nupcial y coloración del saco bucal en machos, formación de amplexos, y colocación de huevos siguiendo los patrones normales descriptos para la especie. En el segundo capítulo se describe el desarrollo normal de larvas de B. pulchella y R. arenarum en condiciones de laboratorio. Para ello se colectaron puestas en los sitios de referencia y se mantuvieron en condiciones controladas de laboratorio realizando extracciones (mediciones y fijaciones) de individuos a intervalos de tiempo regulares. Dichos procedimientos permitieron obtener información suficiente para calcular de manera precisa las tasas de crecimiento, desarrollo y supervivencia, y realizar una descripción cuali y cuantitativa del desarrollo larval normal de las especies de estudio y establecer los parámetros estimados como valores de referencia. Una vez estudiados los caracteres morfológicos normales de las larvas y valores de referencia, se procedió a caracterizar las anormalidades presentes en larvas como consecuencia de su exposición a contaminantes. En una primera instancia se realizó un estudio comparativo de las anormalidades presentes en larvas de Rhinella arenarum procedentes de bioensayos, mediante los cuales las larvas fueron expuestas a 10 contaminantes de relevancia ambiental incluyendo metales y plaguicidas. Dicho análisis permitió identificar más de 20 tipos de anormalidades. Luego, se realizó una búsqueda bibliográfica exhaustiva de publicaciones que informaran sobre la presencia de anormalidades en larvas de anfibios. Se analizaron en detalle y se realizaron comparaciones entre las descripciones buscando identificar patrones comunes, así como también detectar diferencias, desacuerdos y contradicciones. Finalmente, se propuso una lista con la nomenclatura revisada y unificada, acompañada de una descripción de cada una de las anormalidades junto con una valoración de su gravedad según su implicancia en la supervivencia de los individuos. Esta lista sirvió de guía para la identificación de las anormalidades detectadas en los bioensayos y en las larvas de campo (Capítulos siguientes). Los resultados permiten asociar la expresión de anormalidades con la exposición a determinados factores de estrés, esto aporta evidencias para proponer la presencia de anormalidades en larvas de anuro como punto final de evaluación. En el capítulo 3 se describe en detalle la adecuación y puesta a punto de los bioensayos de toxicidad con sedimentos que plantea la incorporación de larvas de especies autóctonas. Para ello se evaluó el patrón de respuesta a nivel individual (efectos letales y subletales) de larvas de B. pulchella y R. arenarum expuestas a sedimentos provenientes de los sitios de estudio. Inicialmente, los protocolos de bioensayos con sedimentos y larvas de anuros estandarizados por USEPA (1996) y ASTM (2007) se analizaron en detalle. Además, se cotejó la información existente sobre la biología, ecología y cría de las larvas de las especies de estudio. Con la información obtenida se determinaron las mejores condiciones para cada especie y se confeccionó un protocolo. Una vez establecido el protocolo se puso a prueba con numerosos ensayos, los que permitieron evaluar su utilidad, su practicidad y realizar ajustes y mejoras. La adecuación y puesta a punto de los protocolos normalizados para ser utilizados con las especies autóctonas propuestas, se llevó a cabo exitosamente. Se realizaron un total de 12 bioensayos en los que se evaluaron los siguientes puntos finales: mortalidad, crecimiento, desarrollo, comportamiento y presencia y frecuencia de anormalidades. Una de las variaciones del protocolo consistió en realizar bioensayos empleando estadios más tempranos del desarrollo como lo es el estadio (STD) 8 (blástula con segmentación media), considerando que la exposición en etapas tempranas del desarrollo aumentaría la probabilidad de ocurrencia de malformaciones, lo que provocaría un aumento no solo en el número (frecuencia de ocurrencia), sino en la gravedad de las anormalidades evaluadas. Posteriormente, y con el objetivo de conocer la sensibilidad de las diferentes etapas del desarrollo, se realizaron bioensayos con sedimentos en tres etapas relevantes: embriones en STD 8 y larvas en STD 25 y 30. Esto permitió conocer la sensibilidad de la respuesta en cada etapa y realizar comparaciones, posibilitando obtener información muy valiosa para el desarrollo de la herramienta propuesta. Finalmente, con el objetivo de obtener información complementaria que permita comprender la respuesta de la herramienta y su versatilidad, se probó el procedimiento propuesto realizando un ensayo de exposición a sedimentos desde STD 8 (embrión) hasta la metamorfosis con la especie Rhinella arenarum. Este permitió obtener información valiosa sobre la respuesta en diferentes etapas y corroborar algunas hipótesis sobre la gravedad y consecuencia de las anormalidades. Por otra parte, con el objetivo de obtener información más detallada sobre la toxicidad de los sedimentos que resultaron más tóxicos al evaluar mortalidad, se realizaron bioensayos empleando diluciones de dichos sedimentos, lo que permitió obtener información sobre efectos subletales. La totalidad de los bioensayos realizados en este capítulo permitió corroborar la factibilidad de los procedimientos desarrollados y la utilidad de la herramienta bioanalítica propuesta, la que demostró ser sencilla, práctica, de bajo costo y precisa en cuanto a sus resultados. La aplicación de esta herramienta permitió clasificar los sedimentos provenientes de los sitios estudiados según su toxicidad. Además, el empleo de la ocurrencia y frecuencia de anormalidades, como posible biomarcador y punto final de evaluación, resultó ser una herramienta útil que brinda información relevante y complementaria al empleo de puntos finales usados convencionalmente (mortalidad, crecimiento y desarrollo). Los resultados obtenidos en este capítulo, constituyen líneas de evidencia a favor de la utilidad de B. pulchella como especie modelo de estudio sensible y útil al momento de evaluar efectos en ecosistemas acuático y evidencia la importancia de evaluar la exposición desde etapas tempranas del desarrollo. Por último, en el capítulo 4 se emplea el conjunto de caracteres morfológicos externos propuestos en los capítulos 2 y 3, incorporando el análisis de caracteres morfológicos internos para evaluar grupos de larvas provenientes de los sitios de estudio. Para ello se consideraron los sitios en los que se detectó la presencia y reproducción de ambas especies estudiadas, y se realizaron muestreos a lo largo del ciclo larval. Las larvas colectadas fueron anestesiadas y fijadas en formol para posteriores análisis en laboratorio. Cada larva fue analizada en detalle bajo lupa estereoscópica determinando y registrando la presencia de anormalidades, además de variables como tamaño y estadio del desarrollo. Con fines comparativos, se seleccionaron grupos de larvas de aspecto normal, y grupos de larvas malformadas, en estadios avanzados, y se procedió a la disección y prospección de anomalías en los órganos internos. Complementariamente, algunos individuos fueron procesados con tinciones que permitieron analizar el desarrollo del condrocráneo y la musculatura mandibular. Los resultados permitieron estimar la frecuencia de ocurrencia de anormalidades y comparar el patrón de respuesta de las larvas expuestas mediante bioensayos con las observaciones realizadas de larvas procedentes de los sitios de estudio. Ello posibilitó corroborar no solo la versatilidad y utilidad de la herramienta aquí propuesta sino también su aplicación en campo. La interpretación de los resultados obtenidos y su contextualización en el marco teórico aquí expuesto, permiten concluir que la presencia de larvas de diferentes especies de anuros, brinda información sobre la calidad del ambiente. Por otro lado la evaluación de puntos finales subletales en larvas de anuros provenientes de ecosistemas acuáticos naturales y antropizados, brindan información que permite inferir la calidad del ambiente y el estado del ecosistema. El hallazgo en el campo de larvas anormales posee gran relevancia ecológica y es un indicador de la ocurrencia previa de un evento de estrés sobre el ecosistema. Considerando los resultados obtenidos y la experiencia adquirida, finalmente se propuso un atlas de anormalidades con la nomenclatura revisada y unificada, acompañado de una descripción de cada una de las anomalías junto con una evaluación de su severidad de acuerdo a su implicación en la supervivencia de los individuos.Facultad de Ciencias Naturales y Muse