Same same but different : a comprehensive functional analysis of SRSF3 and SRSF7 in the regulation of alternative polyadenylation within the 3’ untranslated region

Das klassische zentrale Dogma der Biologie beschreibt die Synthese funktionaler Proteine basierend auf den Informationen, die in der DNA kodiert sind. In einem notwendigen Zwischenschritt wird zunächst die entsprechende DNA-Sequenz in ein messenger-RNA (mRNA) Molekül abgeschrieben (transkribiert), bevor diese RNA-Sequenz durch Ribosomen in das finale Protein übersetzt (translatiert) werden kann. In Eukaryoten sind die Transkription und Translation durch eine Kompartimentierung der Zelle in den Zellkern und das Zytosol örtlich und zeitlich voneinander getrennt. Diese Trennung ermöglicht eine eingehende Qualitätskontrolle der gereiften mRNA im Zellkern, bevor diese durch einen aktiven Prozess in das Zytoplasma exportiert wird. In Eukaryoten liegen die Informationen für die Proteine fragmentiert vor. Kodierende Sequenzen (Exons) werden unterbrochen von nicht-kodierenden Abschnitten (Introns), welche zunächst beide abgeschrieben werden und die prä-mRNA bilden. Diese initiale RNA-Sequenz muss im Anschluss prozessiert werden, um die Introns zu entfernen und die Exons miteinander zu legieren (Spleißen). Die entstehende neue prä-mRNA wird sofort an ihrem 5‘-Ende methyliert, um sie vor dem Verdau durch 5’-Exonukleasen zu schützen (5‘Capping). Abschließend wird die Transkription terminiert, und um das 3‘-Ende ebenfalls vor einem möglichen Abbau zu schützen, erhalten die Transkripte einen so genannten poly(A)-Schwanz, eine Sequenz aus Adenosinen, die nicht in der DNA-Matrize vorgegeben sind (Polyadenylierung). Diese Prozesse werden durch verschiedene Multi-Protein-RNA-Komplexe im Zusammenspiel mit spezifischen RNA-bindenden Proteinen (RBPs) katalysiert. Das Spleißen wird vom Spliceosom durchgeführt, welches mittels zweier aufeinanderfolgender Umesterungen das Intron zwischen zwei Exons entfernt und die Exons miteinander ligiert. Hierbei können auch ein oder mehrere Exons übersprungen werden. Dieses alternative Spleißen (AS) ermöglicht die Expression alternativer Protein-Isoformen aus demselben Gen. Zusätzlich können durch AS aber auch alternative, toxische Exons in die reife mRNA integriert werden, welche die Stabilität des Transkripts negativ beeinflussen und somit eine Möglichkeit zur Regulation der Proteinexpression bieten. Die Assemblierung des Spliceosoms an der prä-mRNA wird durch die Präsenz von RNA-bindenden Spleiß-Aktivatoren oder -Inhibitoren beeinflusst. Eine bekannte Familie von Spleiß-Aktivatoren ist die der Serin/Arginin-reichen Proteine (SR-Proteine). Diese binden spezifische Sequenzen in Exons und fördern die Assemblierung des Spliceosoms an den jeweiligen Spleißstellen und somit die Inklusion der gebundenen Exons. Dem entgegen wirken Inhibitoren, wie die Proteine aus der hnRNP-Familie, die vorzugsweise in Introns binden. Die Transkription einer neuen prä-mRNA wird durch eine hydrolytische Spaltung in der 3‘-untranslatierten Region (UTR) beendet und das neu entstandene 3‘-Ende dieser prä-mRNA wird durch die neue Synthese eines poly(A)-Schwanzes vor der vorzeitigen Degradation geschützt. Diese zusammenhängenden Prozesse werden von vier Multi-Protein-Komplexen (CFIm, CFIIm, CPSF und CsTF) und der Poly(A)-Polymerase (PAP) katalysiert. Die Adenosin-reiche Sequenz wird durch die Bindung des Poly(A)-bindenden Proteins (PABPN1) stabilisiert wodurch die Aktivität von PAP weiter stimuliert wird. Wie Spleißen ist auch die endonukleolytische Spaltung und Polyadenylierung sequenzspezifisch und abhängig von RBPs, die diese Sequenzen erkennen. Das zentrale Erkennungsmotiv ist das Hexamer ‚AAUAAA‘ sowie bestimmte Varianten dieses Motivs. Dieses so genannte Poly(A)-Signal wird durch die spezifischen Untereinheiten WDR33 und CPSF30 des CPSF-Komplexes erkannt. Die Assemblierung der gesamten Polyadenylierungsmaschinerie wird unterstützt durch den CFIm-Komplex, der UGUA-Motive oberhalb des Poly(A)-Signals bindet sowie durch den CsTF-Komplex, der U/GU-reiche Sequenzen unterhalb des Poly(A)-Signals bindet. Analog zum Spleißen ist auch die Polyadenylierung in den meisten eukaryotischen Genen (bei humanen/murinen Zellen in bis zu 70% der Gene) an mehreren Positionen möglich (alternative Polyadenylierung, APA). Abhängig von der Position der alternativen Polyadenylierungsstellen entstehen dadurch entweder Transkripte mit alternativen terminalen Exons, falls diese Stelle in einem Intron liegt (CDS-APA), oder Transkripte mit unterschiedlich langen 3’UTRs aber identischer kodierender Sequenz, wenn die alternativen Poly(A)-Signale in der 3’UTR liegen (3’UTR-APA). In Abhängigkeit von der Entfernung zum vorherigen STOP-Codon wird die erste Polyadenylierungsstelle (PAS) als ‚proximal‘ (pPAS) und die am weitesten entfernte als ‚distal‘ (dPAS) betitelt. Die Länge der 3’UTR hat Auswirkungen auf die Stabilität, Exporteffizienz, subzelluläre Lokalisation, Translationsrate und lokale Translation der entsprechenden mRNA-Isoform. Einzelne Polyadenylierungsfaktoren wurden mit der Expression bestimmter APA-Isoformen in Verbindung gebracht. Die Reduktion von CFIm führte zur vermehrten Expression von Transkripten mit verkürzten 3‘UTRs, wohingegen verringerte Expressionen von CsTF-Komponenten und von FIP1 (Untereinheit des CPSF-Komplexes) die Expression von Transkripten mit langen 3’UTRs förderte. Bisher sind die Komponenten und Funktionen der einzelnen Polyadenylierungsfaktoren umfassend erforscht, dennoch ist die Regulation der alternativen Polyadenylierung – die Entscheidung, ob die proximale oder distale PAS benutzt wird – weniger entschlüsselt und benötigt zusätzliche Studien. ...The central dogma of biology is based on the concatenated transfer of information from DNA, via transcribed mRNA, to the translated protein. In eukaryotes, transcription and translation are separated locally as well as temporally by cellular compartmentalization. Prior to active export factor-dependent transport from the nucleus to the cytosol, the newly formed pre-mRNA must mature. This involves 5'capping, splicing, and endonucleolytic cleavage and polyadenylation (CPA). Transcription of a new pre-mRNA is terminated by hydrolytic cleavage in the 3'-UTR, and the newly formed 3'-end is protected from premature degradation by synthesis of a poly(A) tail. These processes are catalyzed by four multi-protein complexes (CFIm, CFIIm, CPSF, and CsTF) and poly(A) polymerase (PAP). CPA is sequence-specific and dependent on RNA-binding proteins (RBPs). APA-specific sequences include the poly(A) motif ('AAUAAA' and certain motif variants), the UGUA motif, and U/GU-rich sequences upstream and downstream of the poly(A) signal, respectively. About 70% of mammalian genes have more than one polyadenylation site (PAS) and express transcripts of different lengths by a mechanism called alternative polyadenylation (APA). This can affect the length of the 3'UTR (3'UTR-APA) or the coding sequence of the transcript (CDS-APA) if the alternative PAS is upstream of the STOP codon. The length of the 3'UTR affects the stability, export efficiency, subcellular localization, translation rate, and local translation of the nascent transcript. 3'UTR-APA is regulated in the interplay of the cis-elements (poly(A) motif, UGUA and U/GU) and trans-elements (expression of CPA factors). In this context, the functions of the individual cis and trans elements have been extensively studied, yet the regulation of alternative polyadenylation-the decision whether to use the proximal or distal PAS-is less deciphered and requires additional study. In murine P19 cells, we were able to demonstrate for the first time a direct link between 3'UTR-APA and nuclear export of mature mRNA by the splicing factors SRSF3 and SRSF7 and decipher the mechanism. At the core here is the direct recruitment of the export factor NXF1 by SRSF3 and SRSF7 to transcripts with 3'UTRs of different lengths. The primary goal of the thesis presented here was to decipher the function of SRSF3 and SRSF7 in the regulation of 3'UTR-APA and to determine the basic mechanism. For this purpose, various genome-wide methods, such as RNA-Seq, MACE-Seq, and iCLIP-Seq, were integrated and the findings were supported by reporter gene and mutation studies. Initial determination of the poly(A)-tome in P19 cells by MACE-Seq yielded approximately 16,000 PAS and showed that slightly less than 50% of all genes used two or more PAS and expressed alternative 3'UTR isoforms. Further DaPARS analyses after knockdown of Srsf3 or Srsf7 confirmed that SRSF3 affected more transcripts than SRSF7 and led primarily to the expression of long 3'UTRs, whereas SRSF7 promoted the expression of short 3'UTRs. Integration of SRSF3- and SRSF7-specific iCLIP data suggested a possible competition between SRSF3 and SRSF7 at the proximal PAS (pPAS), which could thus act as a hotspot of 3'UTR regulation. Experiments with intron-free reporter genes revealed that SRSF3- and SRSF7-dependent regulation of 3'UTR-APA is independent of splicing. With respect to SRSF7, a concentration dependence was demonstrated. Mutation experiments involving the SRSF3- and SRSF7-specific binding motifs in the 3'UTR also confirmed the hypothesis of competition between the two SR proteins. Extensive Co-IP experiments clearly demonstrated that only SRSF7, but not SRSF3, can interact with CFIm and FIP1 (a subunit from the CPSF complex) in an RNA-independent manner. In addition, we showed that these interactions exhibited some phosphorylation dependence, such that the interaction to FIP1 arose primarily in the semi- to hypophosphorylated state of SRSF7. Whereas the interaction to CFIm was mainly detected in the hyperphosphorylated state. The differential affinity between SRSF3 and SRSF7 for polyadenylation factors could be attributed to two SRSF7-specific domains in subsequent mutation experiments: A CCHC-type Zn finger between the RRM and the RS domain, and a hydrophobic 27 amino acid long region in the middle of the RS domain. Together, this suggested that SRSF3 could block the utilization of pPAS, whereas SRSF7 could activate it by directly recruiting polyadenylation factors. Interestingly, we showed that knockdown of Srsf3 also negatively regulates the expression of Cpsf6 (a subunit of CFIm) through alternative splicing, which subsequently leads to decreased expression of CPSF6 and of CFIm. Reduction of CFIm led to increased expression of transcripts with short 3'UTR, analogous to knockdown of Srsf3. This mirrors the results of previous studies. A direct comparison between SRSF3- and CPSF6-specific transcripts revealed that not all targets were congruent. In addition, we found preliminary evidence for CFIm-related masking of essential cis-pPAS elements by bimodal UGUA motifs at the pPAS. In summary, we present a novel mechanism of indirect 3'UTR-APA regulation through SRSF3-conditional expression of the CFIm subunit CPSF6. ..