Sviluppo e applicazione di un metodo molecolare ultra-sensibile per la ricerca di Plasmodium spp. in campioni a bassa parassitemia

BACKGROUND La malaria è una malattia infettiva causata da parassiti ematici appartenenti al genere Plasmodium spp. L’infezione viene trasmessa all’uomo attraverso la puntura di una zanzara femmina infetta, appartenente al genere Anopheles spp. Le principali specie di parassiti responsabili di malaria nell’uomo sono: P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi. È fondamentale una diagnosi accurata per la corretta gestione della malattia e l’instaurazione di un appropriato e tempestivo regime terapeutico. Ad oggi, in associazione all’inquadramento clinico, la microscopia rappresenta il gold standard per la diagnosi di malaria, sebbene altri validi metodi, come test immunocromatografici (mRDTs), test di emoconcentrazione su capillare (QBC) e test molecolari (rtPCR, LAMP, RPA) coadiuvino il processo diagnostico. La sensibilità di questi metodi varia fortemente in relazione alla densità parassitaria e talvolta i diversi metodi diagnostici possono fornire risultati discordanti rendendo complessa l’interpretazione diagnostica degli stessi. MATERIALI e METODI L’ obbiettivo dello studio è quello di mettere a punto, validare e testare un metodo molecolare molto sensibile basato sulla digital droplet PCR, in grado di rilevare la presenza di Plasmodium spp., utilizzando come target il gene 18S, in campioni di sangue intero e siero. Sono stati analizzati 56 campioni clinici di sangue intero a bassa parassitemia e/o discordanza tra i diversi test diagnostici; 3 campioni artificialmente resi positivi per plasmodi diversi da P. falciparum con bassissima parassitemia; 24 sieri di pazienti con splenomegalia iperreattiva malarica (HMS). RISULTATI e CONCLUSIONI I risultati riportano un’ottima specificità del metodo sul genere Plasmodium spp. e una sensibilità attestata a [0.1 parassiti/µl]. Su 56 campioni clinici di sangue intero analizzato, 8 si sono rivelati positivi per Plasmodium spp. sebbene avessero per QBC/Microscopia/mRDT risultati negativi o discordanti. Dei 24 sieri di pazienti con HMS, 11 sono stati confermati come positivi in ddPCR nonostante avessero esito negativo agli altri test diagnostici. Alla luce delle prove da noi condotte, la ddPCR può essere considerato un saggio robusto e affidabile e può rappresentare un valido ausilio per la conferma dei casi discordanti o la risoluzione di casi poco chiari o criptici