Caratterizzazione di una formulazione probiotica a base di Enterococcus e suoi effetti sul microbiota intestinale di topi obesi

Negli ultimi decenni, i microrganismi con attività probiotiche hanno suscitato un interesse sempre maggiore nella comunità scientifica per le loro proprietà fisiologiche benefiche, i complessi meccanismi d’azione da loro esplicati nell’ospite e la loro capacità di modulare positivamente il microbiota intestinale alterato in numerosi disordini e stati patologici dell’uomo. In questo contesto, gli obiettivi del presente progetto di tesi sono stati quelli di caratterizzare sotto molteplici aspetti una formulazione probiotica a base di batteri appartenenti al genere Enterococcus e, in secondo luogo, di valutare gli effetti della sua somministrazione sul microbiota intestinale in un modello murino di obesità. La caratterizzazione della formulazione probiotica è servita, innanzitutto, per verificare che la quantità di microrganismi all’interno della formulazione e la varietà di specie microbiche presenti fossero concordi con quanto dichiarato sull’etichetta del prodotto commercializzato. Per ottenere un’indicazione del numero di microrganismi vitali nel prodotto, è stata effettuata una conta vitale delle CFU. Per l’identificazione dei microrganismi, alcune colonie isolate sono state prelevate e sottoposte a spettrometria di massa MALDI-TOF. Dalla formulazione è stato estratto il DNA genomico, che è stato sottoposto a sequenziamento del gene codificante per l’rRNA 16S batterico per escludere la presenza di contaminazione nella formulazione da parte di altri ceppi microbici. Da queste analisi è risultato che la formulazione probiotica è conforme in quantità e qualità rispetto a quanto dichiarato dall’azienda produttrice. È stata saggiata, inoltre, la capacità dei microrganismi di sopravvivere in succhi gastrici e intestinali artificiali, tramite incubazione del prodotto nel fluido artificiale e semina di aliquote della sospensione microbica su piastre di agar sangue a diversi tempi di incubazione. La conta delle CFU ottenute, confrontata con quella rilevata nella iniziale conta vitale, ha permesso di determinare se i microrganismi costituenti la formulazione fossero in grado di sopravvivere in condizioni paragonabili a quelle presenti in vivo nell’apparato gastrointestinale. I risultati ottenuti hanno rivelato la presenza di un numero di microrganismi più elevato rispetto a quanto dichiarato in etichetta, mentre l’identificazione a livello di genere e specie è risultata idonea. I saggi di resistenza al succo gastrico artificiale hanno denotato una scarsa percentuale di sopravvivenza dei microrganismi ad un pH di 1.5, che aumenta però ad un pH di 3.0. I saggi di sopravvivenza in succo intestinale artificiale, infine, hanno dimostrato un’elevata sopravvivenza dei batteri in questo mezzo. La formulazione probiotica è stata poi somministrata per via orale a topi ai quali è stato imposto un regime alimentare standard (standard diet, SD) o ad alto contenuto di grassi (high-fat diet, HFD). Dalle feci di questi animali è stato estratto il DNA genomico, che è stato successivamente sottoposto a Real-time PCR quantitativa al fine di rilevare l’abbondanza assoluta di specifici phyla e generi batterici costituenti il microbiota intestinale degli animali. I risultati ottenuti hanno permesso di dimostrare che la somministrazione del prodotto probiotico determina variazioni significative della composizione del microbiota intestinale. Tra le principali differenze osservate tra topi alimentati con dieta standard e quelli con dieta HFD è stato riscontrato un aumento nell’abbondanza dei microrganismi appartenenti al phylum Firmicutes e al genere Faecalibacterium, mentre per i generi Bacteroides e Prevotella è stata osservata una diminuzione. È stata poi evidenziata una riduzione nella quantità di microrganismi appartenenti ai generi Bacteroides, Prevotella e al phylum Firmicutes tra i topi normopeso che avevano ricevuto il probiotico per 4 settimane e quelli a cui non era stato somministrato il trattamento. Per quanto riguarda la comparazione tra i topi obesi a cui non era stato somministrato il probiotico e quelli che lo avevano ricevuto, negli animali trattati con la formulazione probiotica è stata osservata una diminuzione nel numero di microrganismi appartenenti ai phyla Firmicutes e Proteobacteria, mentre per il genere Bifidobacterium è stato riscontrato un aumento