Proprieta' anti-virulenza di un derivato quaternario del chitosano nei confronti di Pseudomonas aeruginosa

Abstract: La diffusione di ceppi batterici resistenti ad agenti antimicrobici rappresenta un grave problema di salute pubblica a livello mondiale. Tra i microrganismi di notevole interesse clinico vi è Pseudomonas aeruginosa, patogeno opportunista responsabile di gravi infezioni nosocomiali, che presenta una spiccata tendenza a sviluppare resistenza nei confronti degli antibiotici. La limitata disponibilità di antibiotici efficaci per il trattamento delle infezioni provocate da ceppi multi-resistenti rende necessaria la ricerca di nuove strategie terapeutiche. Un approccio alternativo alle terapie convenzionali mira ad inibire la produzione di fattori di virulenza dei batteri, al fine di attenuarne il potere patogeno. Recentemente, particolare attenzione è stata rivolta verso polimeri funzionali, quali i derivati quaternari del chitosano, studiati in campo biomedico/farmaceutico e capaci sia di esercitare un’attività antimicrobica diretta che di veicolare principi farmacologici attivi. Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di studiare in vitro le proprietà anti-virulenza di un derivato quaternario del chitosano a basso peso molecolare (QAL) verso quattro ceppi di P. aeruginosa. I risultati ottenuti hanno indicato la capacità di QAL di provocare una significativa riduzione di importanti fattori di virulenza di P. aeruginosa quali la piocianina, la pioverdina, le proteasi totali e la proteasi LasA, in tre su quattro dei ceppi saggiati. Inoltre, QAL ha mostrato la capacità di attenuare la motilità di tipo swarming in due su 4 dei ceppi saggiati. La sintesi di tali fattori di virulenza è sotto il controllo di geni appartenenti al Quorum-Sensing (QS), un sistema di regolazione trascrizionale coinvolto nel controllo della virulenza e della formazione del biofilm. Per tale motivo, è stata saggiata, mediante PCR real-time quantitativa, la capacità di QAL di inibire la trascrizione dei geni lasI e rhlI, componenti del QS di P. aeruginosa. QAL è risultato in grado di ridurre, con differente efficacia, la trascrizione di entrambi i geni. Inoltre, l’analisi effettuata in microscopio confocale di P. aeruginosa incubato con concentrazioni sub-inibenti di QAL ha suggerito che il polimero tende ad accumularsi nel citoplasma delle cellule batteriche. Infine, è stata valutata l’attività antibiofilm di QAL in combinazione con la tobramicina, un antibiotico comunemente utilizzato nella terapia delle infezioni sostenute da P. aeruginosa. La combinazione di concentrazioni sub-inibenti di QAL e tobramicina ha mostrato un marcato effetto sinergico, riducendo significativamente la formazione del biofilm di tutti e quattro i ceppi di P. aeruginosa saggiati. Nel loro insieme, tali dati suggeriscono che QAL possa raggiungere il citoplasma e ridurre la sintesi di fattori di virulenza di P. aeruginosa, inibendo la trascrizione di geni del QS. L’attività anti-virulenza ed anti-biofilm di QAL rendono tale polimero interessante per un potenziale impiego terapeutico, sebbene ulteriori studi in modelli ex-vivo ed in vivo saranno necessari per valutarne meglio potenzialità e limiti. Abstract The spread of bacterial strains resistant to antimicrobial agents represents a major worldwide public health problem. Among the microorganisms of considerable clinical interest, there is Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen responsible for serious nosocomial infections and with a marked tendency to develop resistance to antibiotics. The limited availability of effective antibiotics in the treatment of infections caused by multi-drug-resistant bacterial strains makes it necessary to search for new therapeutic strategies. An alternative approach to conventional therapies aims to inhibit the production of bacterial virulence factors, in order to attenuate bacterial pathogenic potential. Recently, particular attention has been paid to functional polymers, such as quaternary derivatives of chitosan, widely studied in the biomedical/pharmaceutical field and capable of both exerting a direct antimicrobial activity and deliver pharmacologically active principles. The aim of the present thesis was to study in vitro the anti-virulence properties of a low molecular weight quaternized chitosan derivative, named QAL, against four P. aeruginosa strains. The results obtained indicated the ability of QAL to cause a significant reduction of relevant virulence factors of P. aeruginosa such as pyocyanin, pyoverdine, proteases, and LasA elastase, in three out of four P. aeruginosa strains tested. Furthermore, QAL showed the ability to attenuate swarming motility in two out of four bacterial strains tested. The synthesis of these virulence factors is under the control of genes belonging to Quorum-Sensing (QS), a transcriptional regulation system involved in the control of virulence and biofilm formation. For this reason, the ability of QAL to inhibit the transcription of the lasI and rhlI, QS-related genes of P. aeruginosa, was tested by quantitative real-time PCR. QAL was able to reduce, with different effectiveness, the transcription of both genes. Furthermore, the analysis by confocal microscopy of P. aeruginosa incubated with sub-inhibitory concentrations of QAL suggested an intracellular localization of the polymer. Finally, the anti-biofilm activity of QAL was evaluated in combination with tobramycin, an antibiotic largely employed in the treatment of P. aeruginosa infections. The combination of sub-inhibitory concentrations of QAL and tobramycin showed a marked synergistic effect, significantly reducing biofilm formation of all four P. aeruginosa strains tested. Overall, these data suggest that QAL may reach the cytoplasm and reduce the synthesis of virulence factors of P. aeruginosa by inhibiting the transcription of QS-related genes. The anti-virulence and anti-biofilm activity of QAL make this polymer interesting for potential therapeutic applications, although further studies in ex-vivo and in vivo models will be necessary to better evaluate its potential ad therapeutic agent and its eventual limitations