Development of blast resistant rice plants using CRISPR / Cas9 system for genome editing

Rice (Oryza sativa L.) is the main food crop for more than half of the world population but unfortunately, it is severely affected by blast, one of the most widespread and devastating plant diseases, caused by the fungus Magnaporthe oryzae. Hence, the development of rice cultivars with greater resistance to blast is one of the main focuses of breeding programs. However, due to the complex biology of the pathogen, rice cultivars genetically resistant to the fungus become susceptible in a short period of time. In this context, the knockout of rice susceptibility genes represents a flourishing approach to obtain rice cultivars with a broader and longer-lasting resistance to M. oryzae. The present study aimed to use the genomic editing technology - CRISPR/Cas9 system, for knocking-out genes engaged with rice susceptibility to fungal infection. From previous transcriptomics results of two semi-isogenic rice lines - NILs infected by M. oryzae, potential rice-blast susceptibility genes were selected. The prospection of candidate genes for gene editing was complemented by a comparative shotgun proteomic analysis of the protein profile of the interaction between IRBLi-F5 (susceptible) and IRBL5-M (resistant) NILs in early stages of M. oryzae infection, that revealed a specific set of proteins potentially associated with susceptibility. After the characterization and validation of gene expression by RT-qPCR of the most prominent candidates, the target genes OsDjA2, OsERF104 and OsPyl5 were selected and submitted to a functional validation via gene silencing in planta, using antisense oligonucleotides (ASO), in which a clear reduction of leaf symptoms was observed in the compatible identification. Subsequently, the model japonica rice variety Nipponbare was transformed with simplex CRISPR/Cas9 vectors aiming to the independent knockout of each target gene. The T1 progeny of rice-edited plants, homozygous for the null (loss of function)-mutation were tested for blast resistance. As expected, mutant plants showed a decrease of disease symptoms in comparison with control lines (transformant non-edited plants). The results obtained in this study can contribute for the development of rice cultivars resistant to blast disease, besides shedding light on new potential rice-blast susceptibility genes.O arroz (Oryza sativa L.) consiste na principal cultura alimentar de mais da metade da população mundial. Entretanto, esta cultura tem sido severamente atingida pela brusone, uma devastadora doença de plantas causada pelo fungo Magnaporthe oryzae. Dessa forma, o desenvolvimento de cultivares de arroz com maior resistência à brusone consiste em um dos principais focos dos programas de melhoramento. No entanto, devido à complexa biologia do patógeno, cultivares de arroz geneticamente resistentes ao fungo tornam-se suscetíveis em um curto período de tempo. O nocaute (deleção) de genes de suscetibilidade no genoma do arroz representa uma notável estratégia para a obtenção de uma resistência mais ampla e duradoura contra o fungo M. oryzae. O presente estudo teve como objetivo utilizar a tecnologia de edição genômica - sistema CRISPR/Cas9, para o nocaute de genes de arroz envolvidos na susceptibilidade à infecção fúngica. A partir de resultados anteriores de transcriptômica de duas linhagens semi-isogênicas de arroz - NILs submetidas a infecção por M. oryzae, foram selecionados potenciais genes de suscetibilidade. A prospecção por candidatos à edição gênica foi complementada por uma análise proteômica shotgun comparativa do perfil de proteínas da interação entre as NILs IRBLi-F5 (suscetível) e IRBL5-M (resistente) em estágios iniciais da infecção por M. oryzae, que revelou um conjunto específico de proteínas potencialmente associadas à suscetibilidade. Após a caracterização e validação da expressão gênica por RTqPCR dos candidatos mais proeminentes, os genes-alvos OsDjA2, OsERF104 e OsPyl5, foram selecionados e submetidos a validação funcional via silenciamento gênico in planta, utilizando oligonucleotídeos antissenso (ASO), onde se observou notável redução dos sintomas foliares da doença na interação compatível. Em seguida, a variedade-modelo de arroz cv. Nipponbare foi transformada com os vetores CRISPR/Cas9 visando o nocaute, independente, de cada um dos genes-alvo. Plantas de arroz da geração T1 e homozigotas para mutação-nula (perda de função) foram testadas quanto a resistência ao fungo M. oryzae. Conforme esperado, plantas editadas mostraram considerável redução dos sintomas da doença em relação às linhagens controle. Espera-se que os resultados obtidos contribuam para a geração de cultivares de arroz resistentes à brusone, além de lançar luz sobre novos potenciais genes de susceptibilidade à M. oryzaeCAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio