Somatic embryogenesis, expression of the SERK gene in Passiflora ligularis Juss. and influence of irradiance in development and secondary metabolism in vitro in P. mollissima Bailey H.B.K

O presente estudo abordou duas áreas da cultura de tecidos in vitro aplicada ao gênero Passiflora: a regeneração de plantas via embriogênese somática e a biossíntese de metabólitos secundários influenciados pela irradiância. Os objetivos do presente estudo foram estabelecer um protocolo de indução de embriogênese somática a partir de embriões zigóticos maduros caracterizando a expressão do gene SERK durante a morfogênese de Passiflora ligularis, e analisar a influência da irradiância no desenvolvimento vegetal e metabolismo secundário in vitro de Passiflora mollissima. No primeiro capítulo é apresentado um protocolo de indução de embriogênese somática a partir de embriões zigóticos para Passiflora ligularis e a caracterização da expressão do gene SERK por hibridização in situ. Embriões zigóticos maduros foram incubados em meio Murashige & Skoog (MS) suplementado com a combinação de 45,2 µM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 2,2 µM de 6-benziladenina (BA) e 2,3 µM de thidiazuron (TDZ) induzindo a formação de calos embriogênicos e embriões somáticos em estádio globular com padrões similares a outras Passifloras. O teste histoquímico de dupla coloração com carmim acético e azul de Evans confirmou a competência embriogênica do material. Amostras coletadas aos 5, 15 e 35 dias no meio de indução e 5 dias no meio de maturação foram analisadas quanto a expressão do gene SERK por hibridização in situ com sonda heteróloga de Passiflora cincinnata SERK (PcSERK ) confirmando a expressão do gene, particularmente com um sinal forte ao quinto dia no meio de maturação. Para P. ligularis as informações deste estudo constituem o primeiro relato dos eventos de indução e expressão gênica da embriogênese somática a partir de embriões zigóticos. No segundo capítulo objetivou-se avaliar a influência da irradiância no desenvolvimento vegetal e metabolismo secundário de vitroplantas de Passiflora mollissima. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, os tratamentos foram constituídos de três níveis de irradiância fornecidos por lâmpadas de diodo emissor de luz (LED) e fluorescentes (LF): 2LED (33 µmol m -2 s -1 ), 4LED (57 µmol m -2 s -1 ) e 2LF (21µmol m -2 s -1 ). Observou-se influência da irradiância no crescimento e desenvolvimento das vitroplantas. O perfil fitoquímico foi realizado por meio da Cromatografia de Camada Delgada (CCD), para os extratos de folhas, caules e raízes. Encontrou-se que os níveis de irradiância estimularam a biossíntese de taninos, terpenoides, esteroides, saponinas e flavonoides. Segundo a análise histoquímica, os taninos alocam-se nas raízes de P. mollissima. A concentração de flavonoides C- glicosilados (orientina, vitexina e isovitexina) e tanino (ácido tânico) foram determinados pela Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), sendo constatada a interação entre a irradiância e o tipo de órgão na concentração destes compostos fenólicos. A irradiância fornecida com 2LED favorece o aumento na concentração de orientina (1,50 µg g -1 ) e vitexina (6,63 µg g -1 ) nas folhas, 4LED de isovitexina na raiz (0,33 µg g -1 ), e 2LF de ácido tânico na raiz (1,99 µg g -1 ). Para P. mollissima este é o primeiro relato da influência da irradiância no metabolismo secundário, o que contribui à realização de futuros trabalhos e melhoramento dos sistemas de produção de compostos fenólicos in vitro a partir desta espécie.The present study approached two different areas in plant tissue culture applied to Passiflora: plant regeneration through somatic embryogenesis and the secondary metabolite production as affected by light irradiance levels. This study aimed: to establish a protocol for somatic embryogenesis induction from mature zygotic embryos, also characterizing the SERK gene expression during morphogenesis in Passiflora ligularis Juss; and to assess the influences of light irradiance levels over vegetal development and secondary metabolism in Passiflora mollissima. The first chapter presents the protocol for somatic embryogenesis in P. ligularis and the SERK gene characterization through in situ hybridization. Mature zygotic embryos were incubated in Murashige and Skoog (MS) medium with 45.2 µM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 2.2 µM 6-Benzyladenine (BA) and 2.3 µM thidiazuron (TDZ), so inducing the formation of embryogenic calli and globular stage somatic embryos following patterns that are similar to other Passiflora species. The competence embryogenic of the material was confirmed by histochemical tests using Evans blue and acetic carmine double staining. Samples collected after 5, 15 and 35 days in inducing medium and 5 days in maturation medium were used to assess SERK gene expression through in situ hybridization using Passiflora cincinnata SERK (PcSERK) heterologous probe, thus confirming the expression of the gene, especially with a strong signal at fifth day in the maturation medium. This study represents the first report of the events involving induction and gene expression of somatic embryogenesis form zygotic embryos in P. ligularis. The second chapter aimed to determine the influence of irradiance levels over vegetal development and secondary metabolism in P. mollissima. The experiment was conducted in a completely randomized design, the treatments were three levels of irradiance provided by two types of lamps, light emitting diode (LED) and fluorescent (LF): 2LED (33 µmol m -2 s -1 ), 4LED (57 µmol m -2 s -1 ) and 2LF (21 µmol m -2 s -1 ). Influences of irradiance levels over plant development were observed. Phytochemical profiles were obtained through thin layer chromatography (TLC) for roots, stems and leaves extracts. Irradiance levels stimulated tannin, terpenoid, steroid, saponin and flavonoid biosynthesis. Histochemical analyses showed that tannins are allocated in P. mollissima roots. C-glycosylated flavonoids (orientin, vitexin and isovitexin) and tannin (tannic acid) concentration in P. mollissima were determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC), and both irradiance and plant organ affected the concentration of these phenolic compounds. The irradiance provided by 2 LED bulbs increased orientin (1.50 µg g -1 ) an vitexin (6.63 µg g -1 ) concentration in the leaves, 4 LED bulbs increases isovitexin concentration in the roots (0.33 µg g -1 ) and 2 fluorescent bulbs increased tannic acid concentration the roots (1.99 µg g -1 ). This constitutes the first report of the effects of irradiance levels over secondary metabolism in P. mollissima, thus contributing to prospective works aiming the improvement of phenolic compounds in vitro production systems in the species.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio