Identifikation, Charakterisierung und Mutagenese einer neuen NAD-abhängigen Formiatdehydrogenase aus Rhodococcus jostii

Die Arbeit beschreibt die Auffindung und Charakterisierung einer FDH aus Rhodococcus jostii. Das Enzym konnte erfolgreich als Cofaktor-Regenerierungssystem eingesetzt werden. Darüber hinaus sind verschiedene Mutagenese-Experimente beschrieben, welche eine Optimierung des Enzyms für die industrielle Anwendung ermöglichten.:1. Einleitung 1 1.1. Allgemeine Einführung 1 1.1.1. Eigenschaften von Enzymen 1 1.1.2. Veränderungen von Enzymeigenschaften durch Mutagenese 3 1.1.3. Einsatz von Enzymen 4 1.2. Cofaktor-Regenerierung 5 1.2.1. Cofaktoren 5 1.2.2. Prinzip und Bedeutung der Cofaktor-Regenerierung 7 1.2.3. Enzymatische Cofaktor-Regenerierung 8 1.3. Formiatdehydrogenasen 11 1.3.1. Metallabhängige Formiatdehydrogenasen 12 1.3.2. NAD-abhängige Formiatdehydrogenasen 15 1.4. Anwendung von NAD-abhängigen FDH 27 1.5. Motivation und Zielsetzung 30 2. Material und Methoden 32 2.1. Materialien und Geräte 32 2.1.1. Geräte 32 2.1.2. Spezialchemikalien 33 2.1.3. Enzyme 33 2.1.4. Kitsysteme 33 2.1.5. Chromatographiesäulen 34 2.1.6. Weitere Verbrauchsmaterialien 34 2.2. Nukleinsäuren und Bakterienstämme 34 2.2.1. Bakterienstämme 34 2.2.2. Spenderorganismen 34 2.2.3. Plasmide 35 2.2.4. Oligonukleotide 35 2.3. Kultivierung von Mikroorganismen 36 2.3.1. Medien 36 2.3.2. Kultivierung von E. coli-Stämmen 37 2.3.3. Kultivierung von E. coli-Stämmen in Mikrotestplatten 37 2.3.4. Rekombinante Genexpression im 250 mL-Maßstab 37 2.3.5. Rekombinante Genexpression in Mikrotestplatten 38 2.3.6. Stammhaltung 38 2.4. Molekularbiologische Methoden 38 2.4.1. Isolation genomischer DNA aus Bakterien 38 2.4.2. Plasmidisolation 38 2.4.3. Agarose-Gelelektrophorese 38 2.4.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 39 2.4.5. Gibson-Assembly 41 2.4.6. Restriktionsansätze 42 2.4.7. Isolation und Reinigung von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel 42 2.4.8. Transformationstechniken 43 2.4.9. Mutagenesetechniken 44 2.4.10. Sequenzierung von DNA-Fragmenten 44 2.4.11. Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 45 2.5. Biochemische Methoden 46 2.5.1. Einstellung der pH-Werte von Puffersubstanzen 46 2.5.2. Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 46 2.5.3. Proteinquantifizierung 47 2.5.4. Zellaufschluss 48 2.5.5. Proteinreinigung 49 2.5.6. Größenausschlusschromatographie (SEC) 50 2.6. Enzymatische Testverfahren 51 2.6.1. Berechnung der Enzymaktivität 51 2.6.2. Bestimmung der Enzymaktivität im 1 mL-Maßstab 51 2.6.3. Bestimmung der Enzymaktivität in Mikrotestplatten 52 2.6.4. Bestimmung der Enzymstabilität bei unterschiedlichen Temperaturen 52 2.6.5. Bestimmung der Enzymstabilität in Anwesenheit von org. Lösungsmitteln 53 2.6.6. Enzymstabilitätseffekte von Schwermetallen 53 2.6.7. Cofaktor-Regenerierungssysteme 53 2.6.8. Enzymatische Reduktion von Kohlenstoffdioxid 55 2.7. Analysemethoden 55 2.7.1. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 55 2.7.2. Gaschromatographie (GC) 56 2.8. Bioinformatische Methoden 57 2.8.1. In silico-Arbeiten mit DNA-Sequenzen 57 2.8.2. In silico-Arbeiten mit Proteinen 57 2.8.3. In silico-Analyse von Proteineigenschaften 57 2.8.4. Erstellung von Homologiemodellen 58 3. Ergebnisse und Diskussion 59 3.1. Identifizierung hochaktiver NAD-abhängiger Formiatdehydrogenasen 59 3.1.1. Bioinformatische Auswahl von FDH-Sequenzen 59 3.1.2. Vorauswahl potentiell hochaktiver FDH-Varianten 64 3.1.3. Bereitstellung potentiell hochaktiver FDH-Varianten und Bestimmung der kinetischen Parameter 71 3.1.4. Fazit 75 3.2. Proteinbiochemische Charakterisierung der RjFDH 77 3.2.1. Allgemeine Charakteristika 77 3.2.2. Substratspektrum und Inhibition der RJFDH 83 3.2.3. Beeinflussung der Enzymaktivität der RjFDH durch Metallionen 84 3.2.4. Cofaktor-Nutzung der RjFDH 86 3.2.5. Reduktion von CO2 91 3.2.6. Temperaturabhängigkeit und Thermostabilität der RjFDH 97 3.2.7. Einfluss des pH-Werts auf die RjFDH 101 3.2.8. Einfluss von Lösungsmitteln auf die Enzymaktivität 104 3.2.9. Fazit 108 3.3. Leistung der RjFDH als Cofaktor-Regenerierungssystem 111 3.3.1. Cofaktor-Regenerierung in Kombination mit der Alkoholdehydrogenase A 111 3.3.1. Cofaktor-Regenerierung in Kombination mit der Leucin-Dehydrogenase aus Lysinibacillus sphaericus 113 3.3.2. Fazit 115 3.4. Veränderung der Enzymeigenschaften der RjFDH 116 3.4.1. Einfluss von Einzelmutationen auf die thermostabilität der RjFDH 116 3.4.2. Einfluss von Cystein-Resten auf die Enzymstabilität 127 3.4.3. Einfluss des C-terminalen Bereichs der RjFDH auf die Enzymaktivität 141 3.4.4. Veränderung der Cofaktorspezifität der RjFDH 150 Anhang 167 Literaturverzeichnis 174 Eidesstattliche Erklärung 19