Estrategia antioxidante para la protección espermática frente al estrés oxidativo

Los resultados obtenidos en la presene Tesis Doctoral, nos han permitido proponer una serie de mejoras en el manejo de muestras espermáticas descongeladas de ciervo para prevenir los daños producidos por el estrés oxidativo tras la criopreservación, proponiéndose diferentes estrategias antioxidantes. Desde hace años, nuestro grupo de investigación ha venido trabajando en la protección de las muestras espermáticas frente al estrés oxidativo. El daño provocado por el estrés oxidativo en las muestras espermáticas de mamíferos es uno de los principales problemas a los que nos enfrentamos en el campo de la reproducción debido a las características fisiológicas de los espermatozoides, que los hacen especialmente susceptibles. Éstos, pueden verse afectados tanto a nivel genético, poniéndose en riesgo la integridad del ADN espermático, cómo a nivel fisiológico, limitando seriamente el potencial fecundante de los mismos como resultado del daño colateral producido en las proteínas y los lípidos de la membrana plasmática del espermatozoide. Sin embargo, los radicales libres no siempre son perjudiciales para el espermatozoide, de hecho, la presencia de cantidades mínimas son necesarias para que se lleven a cabo procesos tan importantes como la capacitación y la hiperactivación de la motilidad, que son esenciales para que se produzca la fecundación. Por todo lo anteriormente expuesto, no es de extrañar que en los últimos años se hayan estudiado multitud de nuevas estrategias antioxidantes para tratar de reducir los diferentes efectos deletéreos del estrés oxidativo sobre la fisiología espermática, tanto in vivo como in vitro, aunque se hayan obtenido resultados muy dispares. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo se orientó hacia el diseño de medios de cultivo y conservación espermática, en el que la adición de diferentes antioxidantes pudiese modular la producción de radicales libres, como las especies reactivas de oxígeno (ROS), minimizando los efectos deletéreos del estrés oxidativo. Además, el diseño de sistemas de liberación controlada de antioxidantes, ayudaría a aumentar el potencial antioxidante de los mismos, minimizando los posibles efectos adversos, tanto tóxicos como prooxidantes. En primer lugar, en el Capítulo I, estudiamos el efecto protector de la cinnamtannina B-1 (CNB-1), un derivado natural del árbol de la canela, que había mostrado una potente actividad antioxidante en otras especies celulares, pero que nunca antes se había evaluado su capacidad antioxidante en muestras espermáticas. Evaluamos la eficacia de cuatro concentraciones diferentes de CNB-1 (0.1, 1, 10 y 100 ?g/mL). Nuestros resultados mostraron que la CNB-1 fue capaz de prevenir el daño frente al estrés oxidativo, mejorando los parámetros de motilidad objetivos, tales como la linealidad, la progresividad y la velocidad de los espermatozoides. Además, a la máxima concentración testada (100 µM), previno la peroxidación lipídica y redujo la producción de ROS en las muestras sometidas a estrés oxidativo exógeno. Una vez conocidos los efectos beneficiosos de la CNB-1 como agente antioxidante en espermatozoides descongelados de ciervo, decidimos seguir trabajando con la vitamina E, un potente agente antioxidante con el que ya habíamos trabajado previamente en el laboratorio y que a pesar de su elevada capacidad para reducir los radicales libres, ofrecía resultados contradictorios sobre otros parámetros seminales, como la motilidad. Nos propusimos diseñar un sistema de liberación controlada de vitamina E que mantuviera su capacidad antioxidante y que a su vez, delimitara su potencial efecto prooxidante a altas concentraciones, disminuyendo también su potencial efecto tóxico, debido a que por su elevada liposolubilidad, para su empleo se diluye en disolventes hidrosolubles como el etanol o el dimetilsulfóxido (DMSO), que son potencialmente nocivos para los espermatozoides. En el Capítulo II, propusimos utilizar la nanotecnología como una herramienta innovadora en espermatología, formulando nanoemulsiones (NE) que acomodan la vitamina E en su interior, protegiéndola de la oxidación y promoviendo su liberación al medio. Evaluamos la eficacia de las NE que contenían vitamina E a las concentraciones de 6 y 12 mM. Así, observamos que con la adición de las NE, se protegieron las muestras frente a los efectos deletéreos del estrés oxidativo, mejorando la mayoría de los parámetros espermáticos, como la viabilidad, la integridad de los acrosomas, y la actividad mitocondrial, así como se previno la peroxidación lipídica y se redujo la producción de radicales libres. De este modo, destacamos que los efectos positivos observados con la adición de las NE de vitamina E a 12 mM, mejorando la mayoría de parámetros cinemáticos evaluados, sobretodo los de velocidad, no se observaron tras la adición vitamina E libre al medio. En este mismo sentido, teniendo en cuenta los beneficios obtenidos en el capítulo anterior en cuanto a la utilización de la nanotecnología como una herramienta para prevenir el estrés oxidativo, en el Capítulo III evaluamos la eficacia de dos nanosistemas diferentes de liberación controlada de vitamina E: las ya mencionadas NE de vitamina E e hidrogeles (HG) de vitamina E, bien por sí solos o combinados. Nuestros resultados mostraron que todas las formulaciones protegieron a los espermatozoides frente al estrés oxidativo, mejorando casi todos los parámetros cinemáticos y preservando la viabilidad. Además, mantuvieron y protegieron la actividad mitocondrial, evitaron la lipoperoxidación y redujeron la producción de ROS en muestras sometidas a estrés oxidativo exógeno. Las NE ofrecieron los resultados más satisfactorios en comparación directa con los HG y la combinación de ambos nanosistemas. Para finalizar, recapitulando los resultados obtenidos en los difrentes trabajos de la presente Tesis Doctoral, proponemos que la CNB-1 es un potente antioxidante que puede proteger los diferentes parámetros espermáticos y que puede considerarse su uso para implementar el manejo de muestras espermáticas. Además, ofrecemos una nueva herramienta para la protección espermática frente al estrés oxidativo: la nanotecnología. Los sistemas de liberación controlada de fármacos, concretamente los sistemas de liberación prolongada de vitamina E formulada en nanoemulsiones, ofrecen resultados satisfactorios en la preservación de muestras espermáticas, destacando la conservación de la motilidad espermática. Así, nuestros resultados nos animan a considerar a la vitamina E como un excelente antioxidante que podría mejorar la calidad de las muestras espermáticas durante las diferentes técnicas de reproducción asistida que requieren la manipulación espermatica, como la fecundación in vitro o la preselección del sexo, con el fin de mejorar la calidad de las mismas. Proponemos por tanto utilizar la nanotecnología como una herramienta innovadora en espermatología, en la que podremos abordar problemas como el estrés oxidativo con la liberación controlada de diferentes antioxidantes. A su vez se abre un nuevo horizonte en el que la nanotecnología se podría utilizar para la liberación de otras moléculas o compuestos que sean de interés en el mundo reproductivo