Desenvolvimento e funcionalização de nanopartículas de ouro com revestimento de sílica para aplicação na terapia do cancro

Cancer is one of the leading causes of death in the world and its incidence has been increasing over the years. On the other side, the currently available treatments, such as surgery, radiotherapy, and chemotherapy, are characterized by presenting a low efficacy and non-specific toxicity. Particularly, the chemotherapeutic agents are poorly soluble, rapidly degraded or removed from blood circulation and present low selectivity towards the cancer cells. Therefore, there is a huge demand for novel and more effective anti-cancer therapeutics. The recent breakthroughs in nanotechnology paved the way for a new era of anti-cancer medicines. Nanoparticles can be produced with different materials and organizations, among them, the gold-core silica shell (Au-MSS) nanoparticles present advantageous physicochemical and biological properties that make them a promising nanoplatform for cancer therapy. Nevertheless, the successful application of Au-MSS nanoparticles as an effective cancer nanomedicine is hindered by the uncontrolled release of the therapeutic payloads, limited blood circulation time and unfavorable pharmacokinetics. This dissertation work plan aimed at designing and developing a novel Au-MSS surface modification with biofunctional polymers for overcoming the uncontrolled drug release profile, limited nanoparticles’ blood circulation time and ultimately potentiate the therapeutic effect. For that purpose, two different methodologies, electrostatic interaction or chemical linkage, were explored and optimized to functionalize Au-MSS, displaying a rod-like shape, with D-a tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS) and branched polyethyleneimine (PEI). TPGS was selected based on its amphiphilic nature that can act as solubilizer and consequently increase the particles’ colloidal stability. On the other side, PEI due to its cationic nature will be attracted to the negatively charged mesoporous silica surface blocking the particle’ pores and consequently the drug release. Additionally, the rod-like shape of Au-MSS allows the combination of drug delivery with photothermal therapy. The produced Au-MSS nanorods display a uniform morphology and a well-defined gold nucleus and silica shell. Further, the particles’ surface charge was dependent on the synthesis methodology. The particles modified by electrostatic interactions (Au-MSS/TPGS-PEI) were negative (-16.9 and -5.1 mV) whereas the formulations produced by chemical linkage (Au-MSS/TPGS/PEI) resulted in positively charged nanoparticles (+30.9 and +6.8 mV). The successful incorporation of the polymers was confirmed by Fourier Transformed Infrared spectroscopy and thermogravimetric analysis. Moreover, the Au-MSS functionalization did not affect the particles photothermal capacity. However, the Au-MSS/TPGS/PEI nanorods displayed a decreased drug encapsulation efficiency. In vitro assays demonstrated the biocompatibility of Au-MSS and Au-MSS/TPGS-PEI up to concentrations of 200 µg/mL, however, the positively charged formulations only remained biocompatible until 100 and 125 µg/mL. Overall, the results presented in this thesis confirm the successful modification of Au-MSS nanorods with TPGS and PEI. Additionally, it was also demonstrated the potential of Au-MSS formulations for being applied in cancer therapy, where they can act simultaneously as photothermal, drug delivery and bioimaging agents.Atualmente o cancro constitui uma das principais causas de morte em todo o mundo, apresentando uma incidência crescente na população mundial. Os tratamentos convencionais como a cirurgia, radioterapia e quimioterapia caracterizam-se por apresentar uma baixa eficácia terapêutica e toxicidade não específica, o que despoleta diferentes efeitos secundários. A quimioterapia é a abordagem terapêutica mais utilizada na clínica. No entanto, esta apresenta diversas desvantagens relacionadas com a falta de especificidade e a rápida degradação dos agentes quimioterápicos, o que leva a que estes apresentem uma baixa biodisponibilidade. A baixa eficácia terapêutica aliada aos efeitos secundários realçam a necessidade de desenvolver novas terapias anticancerígenas. Os recentes desenvolvimentos na área da Nanotecnologia permitiram o desenvolvimento de novas estratégias, capazes de ultrapassar as desvantagens associadas às terapias atuais, abrindo caminho para uma nova era de medicamentos que possam ser usados no tratamento do cancro. Os sistemas à escala nanométrica (nanopartículas) constituem uma abordagem promissora, uma vez que possuem a capacidade de encapsular fármacos, prevenir a sua degradação prematura, controlar a sua libertação e direcioná-los especificamente para as células cancerígenas. Paralelamente, a terapia fototérmica tem atraído a atenção de diferentes investigadores em todo o mundo. Esta abordagem explora materiais que são capazes de se acumular preferencialmente no tecido tumoral, e que após a sua exposição a estímulos específicos (por exemplo, campo magnético e radiação de infravermelho próximo) induzem um aumento de temperatura, o que leva a efeitos citotóxicos nas células cancerígenas. Desta forma, a terapia combinatória mediada por nanopartículas, é uma das abordagens mais exploradas para melhorar a eficácia das terapias atualmente disponíveis. Entre as diferentes nanopartículas investigadas até ao momento, as nanopartículas de ouro revestidas com sílica mesoporosa (Au-MSS) apresentam propriedades estruturais únicas, que permitem a sua aplicação simultânea na terapia e imagiologia. A atenuação de raios X, o efeito de Raman e a absorção na região do infravermelho próximo, que são características do núcleo de ouro, suportam a aplicação destas nanopartículas como agentes de imagiologia. Para além disto, o ouro também pode ter a capacidade de converter a radiação proveniente de uma fonte de luz em calor, e desta forma exercer efeitos citotóxicos nas células cancerígenas. Este aumento local de temperatura pode sensibilizar as células para a ação dos fármacos (termosensibilização), potenciando o efeito terapêutico destes, ou mesmo promover a morte celular (destabilização da membrana celular ou desnaturação do material genético e proteínas). Por outro lado, a inclusão da camada de sílica mesoporosa protege o núcleo de ouro de fenómenos de degradação e agregação, fornecendo ainda uma capacidade de carga adicional para encapsular as moléculas terapêuticas. No entanto, a aplicação bem-sucedida das Au-MSS como nanoestruturas eficientes no combate ao cancro é dificultada pela libertação descontrolada dos agentes terapêuticos, o reduzido tempo de meia vida na circulação sanguínea e uma farmacocinética desfavorável. O plano de trabalho realizado no âmbito desta dissertação teve como objetivo projetar e produzir Au-MSS modificadas na sua superfície com polímeros biofuncionais, de forma a controlar o perfil de libertação dos agentes terapêuticos, aumentar o tempo de circulação da partícula na corrente sanguínea e, fundamentalmente, potenciar o seu efeito terapêutico. Para este propósito, duas metodologias, interação eletrostática e ligação química, foram otimizadas para funcionalizar as Au-MSS em forma de bastonete com succinato de D-a-tocoferil polietilenoglicol 1000 (TPGS) e polietilenoimina ramificada (PEI). O TPGS, um derivado da vitamina E, foi selecionado com base na sua natureza anfifílica de forma a aumentar a solubilidade e a estabilidade coloidal das nanopartículas. Por outro lado, pode também atuar como um inibidor da glicoproteína P (P-gp) e desta forma permitir o aumento da biodisponibilidade dos agentes quimioterápicos. O PEI, devido à sua natureza catiónica será atraído para a superfície da sílica mesoporosa, de carga negativa, bloqueando os poros das partículas e, consequentemente, a libertação do fármaco neles encapsulados. Para além disso, a protonação dos grupos amina, quando em ambiente ácido, também promoverá a fuga das nanopartículas das vesículas endocíticas e dos lisossomas. As Au-MSS produzidas no âmbito desta dissertação exibem uma morfologia uniforme (forma de bastão), com núcleo de ouro e um revestimento de sílica bem definidos. De forma a funcionalizar as Au-MSS, o TPGS e PEI foram alvo de modificações químicas. Para promover a adsorção electroestática na superfície das Au-MSS, as cadeias do TPGS foram ligadas quimicamente ao PEI utilizando o 1,1-carbonildiimidazol (CDI). Por outro lado, para a ligação química do TPGS e PEI na superfície das Au-MSS, ambos os polímeros foram modificados utilizando isocianato de 3-propil-trietoxisilano (TESPIC). Desta forma, a carga superficial das nanopartículas mostrou-se dependente do processo de síntese. As partículas modificadas por interações eletrostáticas (Au-MSS/TPGS-PEI) apresentaram um potencial zeta com valores negativos (-16,9 e -5,1 mV), enquanto que as formulações produzidas por ligação química (Au-MSS/TPGS/PEI) resultaram em nanopartículas carregadas positivamente (+30,9 e +6,8 mV). O sucesso da ligação dos polímeros às nanopartículas foi confirmado por espectroscopia de infravermelho por transformadas de Fourier e análise termogravimétrica. A funcionalização das Au-MSS mostrou não afetar a capacidade fototérmica das nanopartículas, tendo todas as formulações atingido variações de temperatura de cerca 40 ºC. No entanto, as Au-MSS/TPGS/PEI apresentaram uma menor eficiência de encapsulamento do fármaco. Ensaios in vitro demostraram a biocompatibilidade das Au-MSS e Au-MSS/TPGS-PEI até concentrações de 200 µg/mL, contudo as formulações carregadas positivamente só se mantiveram biocompatíveis até 100 µg/mL e 125 µg/mL. Adicionalmente, por microscopia de confocal foi possível confirmar que as diferentes formulações podem ser internalizadas pelas células cancerígenas, e desta forma permitir a entrega de fármacos no interior das células evitando a sua degradação no meio extracelular, potenciando o efeito terapêutico. Entre as formulações testadas, as Au-MSS/TPGS-PEI apresentaram os resultados físico-químicos e biológicos mais promissores, seguidas pelas Au-MSS/TPGS/PEI (3:1). Em suma, os resultados apresentados nesta tese confirmam que a modificação da superfície das Au-MSS com polímeros TPGS e PEI foi realizada com sucesso. Adicionalmente, foi também confirmado o potencial das Au-MSS para aplicação na terapia do cancro, onde podem realizar simultaneamente entrega de fármacos, fototerapia e imagiologia