Arsenic carcinogenesis and associated mechanisms after environmentally relevant long-term (co)exposures

L'arsènic és un contaminant ambiental amb efectes citotòxics, genotòxics i carcinogènics ben caracteritzats. Malgrat que diversos estudis epidemiològics han associat aquesta exposició al desenvolupament de diferents tipus de càncer, els mecanismes que controlen la carcinogènesi associada a l'arsènic no es coneixen per complet. En aquesta Tesi hem aplicat estudis in vitro per a ampliar el coneixement en relació als mecanismes de carcinogènesi del arsènic, un aspecte necessari per a una adequada avaluació del risc. Entre els mecanismes de carcinogènesi descrits en la literatura, la inducció d'estrès oxidatiu i genotoxicitat durant el procés de metabolització de l'arsènic és el més explorat fins ara. Pel que fa a això, en el primer estudi d'aquesta Tesi confirmem que el dany oxidatiu i genotòxic de l'ADN augmentava progressivament en les cèl·lules exposades crònicament a arsènic. Aquest increment es va observar fins al punt de transformació de les cèl·lules, a partir del qual el dany es reduïa fins a nivells basals. L'enzim AS3MT seguia un patró d'expressió similar als nivells de dany i la seua inhibició va provocar una reducció de la genotoxicitat. D'una altra banda, MTH1 augmentava la seua expressió després del punt de transformació i la seua inhibició provocava un augment del dany i una reducció de la agressivitat del fenotip tumoral. Açò demostra que AS3MT contribueix als efectes genotòxics abans de la transformació associada a l'arsènic, mentre que MTH1 prevé la fixació del dany en l'ADN i facilita la progressió del fenotip transformat. L'arsènic també indueix efectes oncogènics activant vies relacionades amb la resposta a l'estrès. Una altre punt d'interès en aquesta Tesi era avaluar el paper de FRA1 en la carcinogènesi de l'arsènic. Hem descrit que l'expressió de FRA1 augmenta progressivament al llarg de l'exposició crònica a arsènic. A més, identifiquem ERK, p38 i RAS com a activadors essencials en l'estimulació de FRA1 associada a aquesta exposició. D'una altra banda, observem que la inhibició de FRA1 reduïa les característiques típiques de les cèl·lules tumorals. Així doncs, aquest estudi demostra que FRA1 té un paper rellevant en l'agressivitat del fenotip tumoral induït per l'exposició crònica a arsènic. La caracterització de nous mecanismes associats a la carcinogènesi de l'arsènic és essencial per a fer estimacions del risc adequades. No obstant, hi ha altres aspectes a tenir en compte, com pot ser la necessitat d'analitzar els efectes i el comportament de mescles de contaminants. En aquest context, un dels objectius d'aquesta Tesi era avaluar l'impacte d'una co-exposició a llarg termini a arsènic i nanopartícules de poliestirè (PSNPs). El nostre estudi ha demostrat que la exposició combinada accentua el fenotip tumoral de les cèl·lules passades 12 setmanes. A més, la co-exposició a arsènic i PSNPs també augmenta el dany genotòxic. Per tant, aquest estudi evidencia la necessitat d'explorar els efectes a llarg termini de combinacions de contaminants a l'hora de valorar els seus potencials efectes adversos per a la salut.El arsénico es un contaminante ambiental con efectos citotóxicos, genotóxicos y carcinogénicos bien caracterizados. A pesar de que diversos estudios epidemiológicos han asociado esta exposición al desarrollo de distintos tipos de cáncer, los mecanismos que controlan la carcinogénesis asociada al arsénico no se conocen por completo. En esta Tesis hemos aplicado estudios in vitro para ampliar el conocimiento en relación con los mecanismos de carcinogénesis del arsénico, un aspecto necesario para una adecuada evaluación del riesgo. Entre los mecanismos de carcinogénesis descritos en la literatura, la inducción de estrés oxidativo y genotoxicidad durante el proceso de metabolización del arsénico es el más explorado hasta ahora. En este aspecto, en el primer estudio de esta Tesis confirmamos que el daño oxidativo y genotóxico del ADN aumentaba progresivamente en las células expuestas crónicamente a arsénico. Este incremento se observó hasta el punto de transformación de las células, a partir del cual el daño se reducía hasta niveles basales. La enzima AS3MT seguía un patrón de expresión similar a los niveles de daño y su inhibición provocó una reducción de la genotoxicidad. Por otro lado, MTH1 aumentaba su expresión después del punto de transformación y su inhibición provocaba un aumento del daño y una reducción de la agresividad del fenotipo tumoral. Esto demuestra que AS3MT contribuye a los efectos genotóxicos antes de la transformación asociada al arsénico, mientras que MTH1 previene la fijación del daño en el DNA y facilita la progresión del fenotipo transformado. El arsénico también induce efectos oncogénicos activando vías relacionadas con la respuesta a estrés. Otro punto de interés en esta Tesis era evaluar el papel de FRA1 en la carcinogénesis del arsénico. Hemos descrito que la expresión de FRA1 aumenta progresivamente a lo largo de la exposición crónica a arsénico. Además, identificamos ERK, p38 y RAS como activadores esenciales en la estimulación de FRA1 asociada a esta exposición. Por otro lado, observamos que la inhibición de FRA1 reducía las características típicas de las células tumorales. Por lo tanto, este estudio demuestra que FRA1 tiene un papel relevante en la agresividad del fenotipo tumoral inducido por la exposición crónica a arsénico. La caracterización de nuevos mecanismos asociados a la carcinogénesis del arsénico es esencial para hacer estimaciones del riesgo adecuadas. Sin embargo, hay otros aspectos a tener en cuenta, como puede ser la necesidad de analizar los efectos y el comportamiento de mezclas de contaminantes. En este contexto, uno de los objetivos de esta Tesis era evaluar el impacto de una co-exposición a largo plazo a arsénico y nanopartículas de poliestireno (PSNPs). Nuestro estudio ha demostrado que la exposición combinada acentúa el fenotipo tumoral de las células después de 12 semanas. Además, la co-exposición a arsénico y PSNPs también aumenta el daño genotóxico. Por lo tanto, este estudio evidencia la necesidad de explorar los efectos a largo plazo de combinaciones de contaminantes a la hora de valorar sus potenciales efectos adversos para la salud.Arsenic is a ubiquitously distributed environmental pollutant with well-known cytotoxic, genotoxic, and carcinogenic effects. Large human populations are subjected to sustained arsenic exposure mainly via the intake of contaminated water in arsenic-rich areas. Although extensive epidemiological data has linked this exposure to an increase in the incidence of several types of cancers, the mechanisms leading to arsenic-associated carcinogenesis remain incompletely characterized. In this Thesis we have performed extended in vitro studies with the aim to gain new insight into the mechanisms of action leading to arsenic-derived effects, highly valuable for an in-depth risk assessment. Among the described mechanisms of arsenic carcinogenesis, arsenic-induced oxidative stress and genotoxicity remains the most explored up to date. The high levels of reactive oxygen species generated during arsenic biotransformation play a crucial role in its transforming potential. Hence, the first study reported in this Thesis, confirmed that oxidative and chromosomal DNA damage progressively accumulate in cells chronically exposed to arsenic. This increment was observed up to the cells' transformation point, and the DNA damage decreased rapidly thereafter. The arsenic-metabolizing enzyme AS3MT underwent expression changes like those of DNA damage levels and, importantly, its inhibition reduced the arsenic-induced genotoxicity. On the other hand, the stress-protective protein MTH1 was stimulated after the transformation point and its knockdown remarkably increased the levels of DNA damage and decreased the aggressiveness of the oncogenic phenotype. This demonstrates that As3mt gene function contributes to the genotoxic effects before the arsenic-induced transformation, while Mth1 prevents DNA damage fixation and allows the progression of the oncogenic phenotype. Arsenic also induces oncogenic effects by activating stress-related signaling pathways. Hence, another point of interest of this Thesis was to assess the role of FRA1 in arsenic-induced oncogenesis. Fra1 is frequently overexpressed in tumor tissue and, accordingly, we described the progressive stimulation of its expression during the cell transformation process induced by chronic arsenic exposure. The levels of upstream FRA1 activators were monitored at the same time-points and ERK, p38, and RAS were pinpointed as potential drivers of arsenic-associated FRA1 stimulation. In turn, FRA1 overexpression potentially leads to the observed altered expression in downstream target genes such as Pten, Pdcd4, Tgfβ1, Zeb, and Twist. Further, we found that FRA1 knockdown, under chronic arsenic exposure settings, elicits a remarkable impact diminishing the features relative to cells' oncogenic phenotype. Thus, these findings demonstrate the essential role of FRA1 in the aggressiveness of the in vitro transformed phenotype induced by long-term arsenic exposure. The characterization of new mechanisms associated to arsenic carcinogenesis is of utmost importance to obtain accurate risk estimations; however, other aspects of the exposure must be considered as well. Chemical safety research has largely proceeded through a material-by-material approach which results in an incomplete picture of contamination, human exposure and potential hazard effects. The increasing number of environmental pollutants calls for a more comprehensive hazard assessment in which the effects and behavior of mixtures of contaminants are considered. In this context, one of the objectives of this Thesis was to evaluate the impact of the long-term co-exposure to arsenic and micro- and nanoplastics (MNPLs). Remarkably, our third study demonstrated that 12-weeks of arsenic and polystyrene nanoparticles (PSNPs) combined exposure was able to enhance the cancer-like features of the cells' transformed phenotype induced and characterized in the previous studies. In addition, our data show that arsenic-induced DNA damage was also promoted after the co-exposure. Further, we have demonstrated that both pollutants physically interact. Thus, this study brings out the need to further explore the long-term effects of emergent contaminants, such as MNPLs, and to consider co-exposures and complex mixtures when assessing their potential hazardous effects