Rapid diagnostic test for the detection of communicable diseases

La prevenció i el control de les malalties transmissibles depenen, en gran mesura, de la detecció ràpida i eficaç. Els mètodes convencionals per a la detecció d'un patogen, com ara el cultiu microbiològic, generalment requereixen molt de temps, són laboriosos, necessiten personal qualificat i no són aptes com a eines de diagnòstic en el punt d'atenció. El desenvolupament de mètodes de diagnòstic ràpid en el marc dels criteris ASSURED, de l'anglès (A) Affordable, (SS) Sensitive i Didàctiques, (O) User-friendly, (R) Rapid and Robust, (I) Equipment free, and (d) Deliverable to those who need it, Affordable, descrits per l'Organització Mundial de la Salut (OMS), es troben en l'actualitat sota intens estudi. Per tant, la present tesi aborda el disseny i desenvolupament d'estratègies, mètodes i materials per millorar les prestacions analítiques i simplificar el procediment en proves de diagnòstic ràpid, incloses noves estratègies de preconcentració en fase sòlida, mètodes d'amplificació i materials avançats, així com la seva integració en diferents plataformes (principalment biosensors basats en detecció electroquímica i proves en paper amb lectura òptica). En tots els casos, les aplicacions seleccionades es centren en malalties transmissibles, inclosos els patògens transmesos pels aliments i els micobacteris. Amb aquesta finalitat, es comparen dues plataformes basades en paper en diferents configuracions (flux lateral i vertical) en termes de rendiment analític per a la detecció de Mycobacterium. Per aconseguir una millora addicional en el límit de detecció, s'estudia la preconcentració prèvia dels bacteris per separació immunomagnètica. En segon lloc, s'avaluen i es comparen en termes del seu rendiment analític la detecció simultània de Salmonella i E. coli mitjançant flux lateral d'àcid nucleic amb lectura visual i genosensors electroquímics. Si bé aquests mètodes requereixen PCR de doble etiquetatge per a l'amplificació, es poden adaptar fàcilment a termocicladors portàtils que funcionen amb bateries per poder ser realitzats en entorns amb recursos limitats per satisfer les demandes de diagnòstic ASSURED. A més, també es presenta en aquesta tesi la síntesi de polímers magnètics impresos molecularment, per tal de reemplaçar les partícules magnètiques biològicament modificades, i prenent com a model la detecció de biotina i de molècules biotinilades. A més, es realitza la caracterització del material mitjançant diferents tècniques analítiques i es compara, en tots els casos, amb el polímer no imprès. Aquest material biomimètic mostra un gran potencial per a la preconcentració i detecció d'una àmplia gamma d'analits. Malgrat tot els progressos, les tècniques d'amplificació d'àcid nucleic segueixen essent necessàries per assolir els límits de detecció requerits en algunes malalties transmissibles. En aquest sentit, les tècniques d'amplificació isotèrmiques són bons candidats per dur a terme proves de diagnòstic en entorns on la PCR pot ser una barrera. En concret, es descriu en aquest treball la detecció d' E.coli mitjançant un genosensor electroquímic basat en l'amplificació isotèrmica. En aquest cas, s'optimitza la lectura electroquímica per voltamperometria d'ona quadrada en elèctrodes d'un sol ús comparant dues estratègies de marcatge del producte amplificat. És important ressaltar que totes aquestes estratègies apunten a ser utilitzades com a eines per millorar les proves de diagnòstic ràpid en entorns de baixos recursos, per interrompre la cadena d'infecció de malalties transmissibles i permetre, per tant, un tractament precoç.La prevención y el control de las enfermedades transmisibles dependen, en gran medida, de la detección rápida y eficaz. Los métodos convencionales para la detección de un patógeno, como el cultivo microbiológico, generalmente requieren mucho tiempo, son laboriosos, necesitan personal cualificado y no son aptos como herramientas de diagnóstico en el punto de atención. El desarrollo de métodos de diagnóstico rápido en el marco de los criterios ASSURED, del inglés (A) Affordable, (SS) Sensitive and Specific, (U) User-friendly, (R) Rapid and Robust, (E) Equipment free, and (D) Deliverable to those who need it, Affordable, descritos por la Organización Mundial de la Salud (OMS), se encuentran en la actualidad bajo intenso estudio. Por lo tanto, la presente tesis aborda el diseño y desarrollo de estrategias, métodos y materiales para mejorar las prestaciones analíticas y simplificar el procedimiento en pruebas de diagnóstico rápido, incluidas nuevas estrategias de preconcentración en fase sólida, métodos de amplificación y materiales avanzados, así como su integración en diferentes plataformas (principalmente biosensores basados en detección electroquímica y pruebas en papel con lectura óptica). En todos los casos, las aplicaciones seleccionadas se centran en enfermedades transmisibles, incluidos los patógenos transmitidas por los alimentos y las micobacterias. Con este fin, se comparan dos plataformas basadas en papel en diferentes configuraciones (flujo lateral y vertical) en términos del rendimiento analítico para la detección de Mycobacterium. Para lograr una mejora adicional en el límite de detección, se estudia la preconcentración previa de las bacterias por separación inmunomagnética. En segundo lugar, se evalúan y se comparan en términos de su rendimiento analítico la detección simultánea de Salmonella y E. coli mediante flujo lateral de ácido nucleico con lectura visual y genosensores electroquímicos. Si bien estos métodos requieren PCR de doble etiquetado para la amplificación, se pueden adaptar fácilmente a termocicladores portátiles que funcionan con baterías para poder ser realizados en entornos con recursos limitados para satisfacer las demandas de diagnóstico ASSURED. Además, también se presenta en esta disertación la síntesis de polímeros magnéticos impresos molecularmente, con el objeto de reemplazar las partículas magnéticas biológicamente modificadas, y tomando como modelo la detección de biotina y moléculas biotiniladas. Además, se realiza la caracterización del material mediante diferentes técnicas analíticas y se compara, en todos los casos, con el polímero no impreso. Este material biomimético muestra un gran potencial para la preconcentración y detección de una amplia gama de analitos. A pesar de todo este progreso, las técnicas de amplificación de ácido nucleico siguen siendo necesarias para alcanzar los límites de detección requeridos en algunas enfermedades transmisibles. Las técnicas de amplificación isotérmica son buenos candidatos para llevar pruebas de diagnóstico en entornos donde la PCR puede ser una barrera. En concreto, se describe en esta disertación la detección de E. coli mediante un genosensor electroquímico basada en la amplificación isotérmica. En este caso, se optimiza la lectura electroquímica por voltamperometría de onda cuadrada en electrodos desechables comparando dos estrategias de marcaje del producto amplificado. Es importante resaltar que todas estas estrategias apuntan a ser utilizadas como herramientas para mejorar las pruebas de diagnóstico rápido en entornos de bajos recursos, para interrumpir la cadena de infección de enfermedades transmisibles y permitir, por tanto, un tratamiento precoz.The prevention and control of communicable disease rely, to a large extent, on effective and early detection approaches. Conventional methods for the detection of a pathogen, such as microbiological culture, are usually time-consuming, laborious, need skilled personnel and are non-amenable to point-of-care diagnostic tools. The development of rapid diagnostic methods in the framework of the ASSURED criteria as (A) Affordable, (SS) Sensitive and Specific, (U) User-friendly, (R) Rapid and Robust, (E) Equipment free, and (D) Deliverable to those who need it, outlined by the World Health Organization (WHO), are under intensive study. Therefore, the present dissertation addresses the design and development of strategies, methods and materials to improve the analytical performance and to simplify the analytical procedure in rapid diagnostic tests, including novel solid-phase preconcentration strategies, amplification methods and advanced materials, as well as their integration in different platforms (mainly biosensors based on electrochemical detection and paper-based strips for optical readout). In all instances, the applications selected are focused on communicable diseases, including foodborne pathogens and mycobacteria. Therefore, two paper-based platforms in different configurations (nucleic acid lateral and vertical flow) are compared in terms of the analytical performance for the detection of Mycobacterium. In order to achieve a further improvement in the limit of detection, the preconcentration of the bacteria is performed by immunomagnetic separation. Secondly, the simultaneous detection of Salmonella and E. coli by nucleic acid lateral flow with visual readout and electrochemical genosensing are evaluated and compared in terms of their analytical performance. Although these methods required double-tagging PCR for amplification, portable, battery-powered thermocyclers can easily be adapted for resource-constrained settings to meet the demands for ASSURED diagnosis. Furthermore, the synthesis of Magnetic Molecularly Imprinted Polymers, in order to replace biological-modified magnetic particles is also presented in this dissertation, taking as a model the detection of biotin and biotinylated molecules with outstanding performance. Moreover, the characterization of the material is performed by different analytical techniques and compared, in all instances, with the non-imprinted polymer. This biomimetic material shows a great potential for the preconcentration and detection of a huge range of analytes. Despite all these progress, nucleic acid amplification techniques are still necessary to reach the challenging limits of detection required in some communicable disease. Isothermal amplification techniques are good candidates to bring sensitive diagnostic tests in places where the PCR can be a barrier. In detail, the electrochemical genosensing of E. coli based on isothermal amplification is also described in this dissertation. In this approach, the electrochemical readout by square-wave voltammetry on disposable electrodes is optimized comparing two different labelling approaches. It is important to highlight that all these strategies aim to be used as tools for the improvement of rapid diagnostic test in low resource settings, to interrupt the chain of infection of communicable diseases and enabling the rapid treatment