Potencial ús de la curcumina en el tractament de la Leucèmia Limfocítica Crònica

La curcumina és un compost fenòlic present en el rizoma de la Curcuma longa, que ha estat extensament estudiat en diversos models de càncer, per les seves propietats proapoptòtiques, antiinflamatòries i quimiosensibilitzadores, entre d'altres. Els seus efectes com a inhibidor enzimàtic en múltiples vies metabòliques relacionades amb la progressió del càncer la fan un compost molt selectiu, amb activitat antineoplàsica alhora que presenta una molt baixa toxicitat. La Leucèmia Limfocítica Crònica (LLC) és una malaltia hematològica d'elevada incidència en països occidentals, originada per una expansió patològica de les cèl·lules B, a causa d'unes taxes d'apoptosi reduïdes. Malgrat que les taxes de proliferació d'aquestes cèl·lules solen ser més baixes que en altres neoplàsies, són molt difícils d'erradicar completament, i els pacients solen recaure amb el temps. La progressió de la malaltia cap a fases més avançades, que requereixen tractaments més complexos i freqüents, acaba afectant la qualitat de vida dels pacients i limitant-ne l'esperança de vida, de manera que resulta d'elevat interès trobar millores en les teràpies que permetin, per una banda, reduir les dosis i els efectes adversos, i per una altra, millorar el tractament i retardar la progressió. En aquesta Tesi Doctoral s'ha estudiat l'efecte de la curcumina sobre models cel·lulars derivats de LLC, així com en cultius primaris obtinguts a partir de sang perifèrica de pacients amb LLC, a fi de valorar el potencial per induir apoptosi sobre les cèl·lules d'aquesta leucèmia. Les primeres anàlisis van consistir en mesurar sobre tres models cel·lulars de LLC (I83, Mec1 i EHEB) l'efecte sinèrgic de la curcumina en combinació amb diversos fàrmacs proapoptòtics (camptotecina, colquicina), antineoplàsics (etopòsid i citarabina) i utilitzats en el tractament de la LLC (fludarabina). Es va mesurar per citometria de flux l'efecte citotòxic produït en funció de la pèrdua de la integritat de la membrana cel·lular i el bloqueig de la proliferació, així com els efectes sobre el cicle cel·lular. A més, es van realitzar citocentrifugacions de les mostres i es van analitzar per microscòpia òptica per avaluar els efectes produïts sobre la citomorfologia. L'efecte sinèrgic de la curcumina també es va valorar sobre cultius primaris derivats de sang perifèrica de pacients amb LLC. En aquest cas, la curcumina va ser combinada amb diversos fàrmacs utilitzats en el tractament de la LLC: fludarabina, ibrutinib i rituximab. Mitjançant la citometria de flux, es va identificar la població leucèmica, així com les subpoblacions amb característiques de cèl·lula mare, més primitives i refractàries (mitjançant els nivells d'activitat de la fosfatasa alcalina) i es va mesurar l'efecte dels diferents tractaments sobre les cèl·lules. Finalment, s'ha avaluat l'efecte modulador de la curcumina sobre diversos mecanismes implicats en l'apoptosi de les cèl·lules i la refractarietat als tractaments. Així, s'han avaluat els efectes sobre la producció d'espècies reactives de l'oxigen (ROS), sobre l'extrusió de fàrmacs i sobre l'activitat caspasa. La curcumina va mostrar un efecte sinèrgic variable en combinació amb els diversos fàrmacs testats, tant en models cel·lulars com en cultius primaris, i va produir un augment de la citotoxicitat, un bloqueig del cicle cel·lular i una reducció dels percentatges de cèl·lules amb característiques de cèl·lula mare leucèmica. A més, la curcumina va mostrar activitat en certs casos modulant la producció de ROS, la capacitat d'extrusió de fàrmacs i generant l'activació de les caspases. Els resultats obtinguts confirmen el potencial proapoptòtic i adjuvant de la curcumina i justifiquen la realització de nous estudis dirigits a una potencial implementació de la curcumina en els tractaments.La curcumina es un compuesto fenólico presente en el rizoma de la Curcuma longa, que ha sido estudiado en varios modelos de cáncer, por sus propiedades proapoptóticas, antiinflamatorias y quimiosensibilizadoras, entre otras. Sus efectos como inhibidor enzimático en múltiples vías metabólicas relacionadas con la progresión del cáncer la hacen un compuesto muy selectivo, con actividad antineoplásica a la vez que presenta una muy baja toxicidad. La Leucemia Linfocítica Crónica (LLC) es una enfermedad hematológica de elevada incidencia en países occidentales, originada por una expansión patológica de las células B, debido a unas tasas de apoptosis reducidas. A pesar de que la proliferación de estas células suele ser menor que en otras neoplasias, son muy difíciles de erradicar completamente, y los pacientes suelen recaer con el tiempo. La progresión de la enfermedad hacia fases más avanzadas, que requieren tratamientos más complejos y frecuentes, afecta la calidad de vida de los pacientes y limita su esperanza de vida, por lo que resulta de elevado interés encontrar mejoras en las terapias que permitan, por una parte, reducir las dosis y los efectos adversos, y por otra, mejorar el tratamiento y retrasar la progresión. En esta Tesis Doctoral se ha estudiado el efecto de la curcumina sobre modelos celulares de LLC, y en cultivos primarios obtenidos a partir de sangre periférica de pacientes con LLC, a fin de valorar el potencial para inducir apoptosis sobre las células de esta leucemia. Los primeros análisis consistieron en medir sobre tres modelos celulares de LLC (I83, MEC1 y EHEB) el efecto sinérgico de la curcumina en combinación con varios fármacos proapoptóticos (camptotecina, colchicina), antineoplásicos (etopósido y citarabina) y utilizados en el tratamiento de la LLC (fludarabina). Se midió por citometría de flujo del efecto citotóxico producido en función de la pérdida de la integridad de la membrana celular y el bloqueo de la proliferación, así como los efectos sobre el ciclo celular. Además, se realizaron citocentrifugaciones de las muestras y se analizaron por microscopía óptica para evaluar los efectos producidos sobre la citomorfologia. El efecto sinérgico de la curcumina también se valoró sobre cultivos primarios derivados de sangre periférica de pacientes con LLC. En este caso, la curcumina fue combinada con varios fármacos utilizados en el tratamiento de la LLC: fludarabina, ibrutinib y rituximab. Mediante citometría de flujo, se identificó la población leucémica, y las subpoblaciones con características de célula madre, más primitivas y refractarias (mediante los niveles de actividad de la fosfatasa alcalina) y se midió el efecto de los diferentes tratamientos sobre las células. Finalmente, se evaluó el efecto modulador de la curcumina sobre varios mecanismos implicados en la apoptosis de las células y la refractariedad a los tratamientos. Así, se han evaluado los efectos sobre la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), sobre la extrusión de fármacos y sobre la actividad caspasa. La curcumina mostró un efecto sinérgico variable en combinación con los fármacos testados, tanto en modelos celulares como en cultivos primarios, y produjo un aumento de la citotoxicidad, un bloqueo del ciclo celular y una reducción de los porcentajes de células con características de célula madre leucémica. Además, la curcumina mostró actividad en ciertos casos modulando la producción de ROS, la capacidad de extrusión de fármacos y generando la activación de las caspasas. Los resultados obtenidos confirman el potencial proapoptótico y adyuvante de la curcumina y justifican la realización de nuevos estudios dirigidos a una potencial implementación de la curcumina en los tratamientos.Curcumin is a phenolic compound present in the rhizome of Curcuma longa, which has been extensively studied in various cancer models, for its proapoptotic, anti-inflammatory and chemosensitizing properties, among others. Its effects as an enzyme inhibitor in multiple metabolic pathways related to cancer progression make it a very selective compound, with antineoplastic activity while presenting low toxicity. Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a high-incidence hematologic disease in Western countries, caused by a pathological expansion of B cells, due to reduced rates of apoptosis. Although the proliferation rates of these cells are usually lower than in other neoplasms, they are difficult to eradicate completely, and patients often relapse over time. The progression of the disease to more advanced stages, which require more complex and frequent treatments, results in a reduction of the quality of life of patients and limiting their life expectancy, so it is of great interest to improve therapies, which would allow, on the one hand, to reduce the doses and the adverse effects, and on the other hand, to improve the treatment and to delay the progression. This Doctoral Thesis has studied the effect of curcumin on cell models derived from CLL, as well as in primary cultures obtained from peripheral blood of patients with CLL, in order to assess the potential to induce apoptosis on the cells of this leukemia. The first analysis consisted on measuring on three cellular models of CLL (I83, Mec1 and EHEB) the synergistic effect of curcumin in combination with various proapoptotic drugs (camptothecin, colchicine), antineoplastics (etoposide and cytarabine) and used in treatment of CLL (fludarabine). Flow cytometry was used to measure the cytotoxic effect produced depending on the loss of cell membrane integrity and proliferation blockade, as well as effects on the cell cycle. In addition, cytocentrifugations of the samples were performed and analyzed by optical microscopy to evaluate the effects produced on cytomorphology. The synergistic effect of curcumin was also assessed on primary cultures derived from peripheral blood from patients with CLL. In this case, curcumin was combined with several drugs used in the treatment of CLL: fludarabine, ibrutinib, and rituximab. Leukemic population was identified by flow cytometry, as well as the subpopulations with more primitive and refractory stem cell characteristics (detected using alkaline phosphatase activity levels) and the effect of the different treatments on cells. Finally, the modulatory effect of curcumin on various mechanisms involved in cell apoptosis and refractoryness to treatments has been evaluated. Thus, the effects on reactive oxygen species (ROS) production, drug extrusion, and caspase activity have been evaluated. Curcumin showed a variable synergistic effect in combination with tested drugs, both in cell models and in primary cell cultures, and produced an increase in cytotoxicity, a blockage of the cell cycle and a reduction of cells with leukemic stem cell characteristics. In addition, curcumin showed activity in certain cases by modulating ROS production, drug extrusion capacity, and generating caspase activation. The results obtained confirm the proapoptotic and adjuvant potential of curcumin and justify the performance of new studies aimed at a potential implementation of curcumin in treatments