Pneumocystis jirovecii en el siglo XXI

La pneumònia per Pneumocystis jirovecii (PJP) ha experimentat canvis en la seva epidemiologia en les últimes dècades, sobretot en països amb accés als tractaments antiretrovirals d'alta eficàcia. La prevalença de la PJP en pacients immunocompromesos VIH negatius (oncològics, hematològics, trasplantats, malalties autoimmunes o aquells que reben teràpies immunodepressores) està en augment. En ells, en general, la infecció és més aguda i greu, presentant major requeriment d'ingrés a UCI i mortalitat més elevada, comparat amb els VIH positius. El seu diagnòstic es veu dificultat perquè característicament cursa amb menor càrrega fúngica i, sovint, no es poden sotmetre a una fibrobroncoscòpia, posant en evidència la necessitat de millorar el rendiment les eines convencionals per al diagnòstic de laboratori. D'altra banda, conèixer la diversitat genètica de Pneumocystis pot facilitar la comprensió de la seva ecologia. Aquest coneixement s'ha vist limitat fins a la data per l'absència d'un mètode de tipat estandarditzat amb rendiment acceptable. Els objectius principals d'aquesta tesi són: (i) avaluar el rendiment de dues PCR a temps real sobre mostres obtingudes de manera invasiva i no invasiva per a optimització de la diagnosi de la PJP, especialment en població no VIH, així com la influència de la diana utilitzada, i generant els corresponents criteris d'interpretació; (ii) comparar el rendiment de dos esquemes de MLST (β-TUB, DHPS, mt26S, ITS versus CYB, mt26S, SOD) proposats prèviament i possibles combinacions alternatives de les seves loci per identificar l'estratègia MLST més adequada per al genotipat de Pneumocystis, prestant atenció a la influència de la càrrega fúngica sobre la taxa d'amplificació i (iii) utilitzar la combinació de loci amb millor rendiment descriure l'epidemiologia molecular de Pneumocystis en una cohort retrospectiva en un hospital terciari de Barcelona, incloent pacients colonitzats i infectats. Independentment de la diana de la PCR utilitzada, les mostres de rentat oral van resultar útils per al diagnòstic ràpid i precís de la PJP, mitjançant una interpretació qualitativa dels resultats. També van resultar útils en la seva aplicació a mostres invasives, encara que es requereix interpretació quantitativa dels resultats. La càrrega fúngica va tenir impacte en les taxes d'èxit de seqüenciació, principalment en els loci nuclears. Una selecció acurada de dianes i l'optimització de protocols tècnics va permetre identificar la combinació de CYB, mt26S, β-TUB i SOD com la més adequada i discriminatòria per al genotipat de Pneumocystis, millorant el rendiment pel que fa als dos esquemes MLST prèviament descrits. La nova combinació de loci va mostrar una elevada diversitat genètica present en la cohort, sense predomini de seqüenciotips. No es va identificar associació entre variants al·lèliques o seqüenciotips i trets clínics. L'esquema MLST seleccionat va permetre descartar la transmissió creuada del fong entre pacients.La neumonía por Pneumocystis jirovecii (PJP) ha experimentado cambios en su epidemiología en las últimas décadas, sobre todo en países con acceso a los tratamientos antirretrovirales de alta eficacia. La prevalencia de la PJP en pacientes inmunocomprometidos VIH negativos (oncológicos, hematológicos, trasplantados, enfermedades autoinmunes o aquellos que reciben terapias inmunodepresoras) está en aumento. En ellos, por lo general, la infección es más aguda y grave, presentando mayor requerimiento en UCI y mortalidad más elevada, comparado con los VIH positivos. Su diagnóstico se ve dificultado porque característicamente cursa con menor carga fúngica y, con frecuencia, no pueden someterse a una fibrobroncoscopia, poniendo en evidencia la necesidad de mejorar el rendimiento las herramientas convencionales para el diagnóstico de laboratorio. Por otra parte, conocer la diversidad genética de Pneumocystis puede facilitar la comprensión de su ecología. Este conocimiento se ha visto limitado hasta la fecha por la ausencia de un método de tipado estandarizado con rendimiento aceptable. Los objetivos principales de esta tesis son: (i) evaluar el rendimiento de dos PCR a tiempo real sobre muestras obtenidas de forma invasiva y no invasiva para optimización del diagnóstico de la PJP, especialmente en población no VIH, así como la influencia de la diana utilizada, y generando los correspondientes criterios de interpretación; (ii) comparar el rendimiento de dos esquemas de MLST (β-TUB, DHPS, mt26S, ITS versus CYB, mt26S, SOD) propuestos previamente y posibles combinaciones alternativas de sus loci para identificar la estrategia MLST más adecuada para el genotipado de Pneumocystis, prestando atención a la influencia de la carga fúngica sobre la tasa de amplificación y (iii) utilizar la combinación de loci con mejor rendimiento describir la epidemiología molecular de Pneumocystis en una cohorte retrospectiva en un hospital terciario de Barcelona, incluyendo pacientes colonizados e infectados. Independientemente de la diana de la PCR utilizada, las muestras de lavado oral resultaron útiles para el diagnóstico rápido y certero de la PJP, mediante una interpretación cualitativa de los resultados. También resultaron útiles en su aplicación a muestras invasivas, aunque se requiere interpretación cuantitativa de los resultados. La carga fúngica tuvo impacto en las tasas de éxito de secuenciación, principalmente en los loci nucleares. Una selección cuidadosa de dianas y la optimización de protocolos técnicos permitió identificar la combinación de CYB, mt26S, β-TUB y SOD como la más adecuada y discriminatoria para el genotipado de Pneumocystis, mejorando el rendimiento con respecto a los dos esquemas MLST previamente descritos. La nueva combinación de loci revelo una elevada diversidad genética presente en la cohorte, sin predominancia de secuenciotipos. No se identificó asociación entre variantes alélicas o secuenciotipos y rasgos clínicos. El esquema MLST seleccionado permitió descartar la transmisión cruzada del hongo entre pacientes.In recent decades the epidemiology of Pneumocystis jirovecii pneumonia (PJP) has experienced changes, particularly in countries with access to highly effective antiretroviral treatment. The prevalence of PJP in immunocompromised HIV-negative patients (oncological, hematological, transplanted, autoimmune diseases or those receiving immunosuppressive therapies) is increasing. They experience an infection that, in general, is more acute, more severe, with a greater requirement of advanced vital support and a higher mortality as compared to HIV-positive patients. The diagnosis of PJP in the former is hampered by their low fungal loads and a critical condition that impede the performance of a bronchoscopy, highlighting the need to improve the performance of conventional laboratory diagnostic tools. On the other hand, a deeper knowledge of the genetic diversity of Pneumocystis could facilitate the understanding of its ecology. To date, this knowledge has been limited by the absence of a standardized typing method with acceptable performance. The main objectives of this thesis are: (i) to optimize the diagnosis of PJP, especially in non-HIV population, by evaluating the performance of two real-time PCRs on invasively and non-invasively obtained samples, the assessment of the influence of the genetic target and the generation of interpretation criteria; (ii) to compare the performance of two previously proposed MLST schemes (β-TUB, DHPS, mt26S, ITS versus CYB, mt26S, SOD) as well as possible alternative combinations of loci to identify the most suitable MLST strategy for Pneumocystis genotyping, paying attention to the influence of fungal load on the rate of amplification and (iii) using the best performing combination of loci, to describe the molecular epidemiology of Pneumocystis in a retrospective cohort in a tertiary hospital in Barcelona, including colonized and infected patients. Regardless of the PCR target used, the oral lavage samples proved to be useful for the rapid and accurate diagnosis of PJP, through a qualitative interpretation of the results. Both PCR were also useful in their application to invasive samples, although quantitative interpretation of the results is required. The fungal load had an impact on sequencing success rates, mainly in nuclear loci. A careful selection of targets and the optimization of technical protocols allowed the identification of CYB-mt26S-β-TUB-SOD as the most suitable and discriminatory combination for Pneumocystis genotyping, improving the performance with respect to the two previously described MLST schemes. The new combination of loci revealed a high genetic diversity present in the cohort, without predominance of sequence types. No association was identified between allelic variants or sequence types and clinical features. The selected MLST scheme allowed to rule out cross transmission of the fungus between patients