Avaliação da diversidade de Corollospora maritima sensu lato, em isolados da costa portuguesa

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasEsta dissertação teve como foco a caracterização dos isolados de Corollospora marítima (fungo marinho da família Halosphaeriaceae) da coleção FCUL e de novas amostras recolhidas na costa portuguesa de modo a comparar a sua diversidade genética com a diversidade observada noutras regiões geográficas, e que levou a que seja considerada uma espécie críptica. A caracterização dos exemplares de C. marítima foi feita através da avaliação morfológica de isolados e de amostras ambientais a partir das quais não foi possível fazer isolamentos, e da avaliação molecular de sequências obtidas a partir dos produtos de PCR às amostras de DNA que amplificaram adequadamente na presença de primers específicos para a região ITS (internal trancribed spacer) do RNA ribossomal nuclear, que compreende os espaçadores ITS1 e ITS2 e o gene 5,8S. As sequências obtidas no âmbito deste estudo, conjuntamente com as sequências dos membros do género Corollospora presentes nas bases de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) e NBRC (National Institute of Technology and Evaluation Biological Resource Center), foram alvo de análises filogenéticas e de cálculo de distâncias genéticas entre si. Neste trabalho foram obtidos dois novos isolados de C. marítima recorrendo à metodologia do esporo único, provenientes de colmos recolhidos em praias da região de Cascais. A partir de amostras ambientais, não cultiváveis, de três regiões diferentes da costa portuguesa, foram obtidas quatro sequências genómicas, que se juntaram às restantes sequências. A caracterização morfológica fez-se ao nível macroscópico e microscópico, aos isolados da coleção FCUL e aos novos isolados, após crescimento em três meios de cultura diferentes. A caracterização microscópica abrangeu todas as amostras de C. marítima disponíveis, incluindo estruturas preservadas em preparações definitivas da coleção FCUL e estruturas presentes em amostras ambientais, para além das diferenciadas nos isolados em crescimento em meio de cultura. A caracterização molecular consistiu inicialmente na identificação das espécies a que pertenciam as sequências obtidas neste estudo, por pesquisa através de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) na base de dados NCBI, onde verificámos se correspondiam a C. marítima. Essas e outras sequências presentes nas bases de dados, de C. marítima e de outras espécies do género Corollospora, foram sujeitas a um alinhamento, a partir do qual foi obtida uma matriz de distâncias entre pares de sequências, a partir da qual, concluímos a necessidade de realizar alinhamentos parciais entre grupos de sequências classificadas como pertencentes à mesma espécie. A matriz de distâncias gerada com o alinhamento parcial das sequências da região ITS atribuídas a isolados de C. marítima revelou a existência de pelo menos três espécies dentro deste grupo: C. marítima, uma espécie que já tinha sido definida como C. portsaidica, e uma nova espécie que propomos designar como Corollospora pseudomarítima. Os alinhamentos parciais também permitiram propor valores de distância que permitam distinguir entre espécies e géneros na família Halosphaeriaceae. Após as avaliações feitas com base nos alinhamentos parciais foram, quando possível, selecionadas as duas sequências com maior tamanho e distância entre si, dentro de cada grupo, para submeter a um alinhamento global para cálculo de distâncias e análises filogenéticas. Uma primeira avaliação foi baseada na região ITS, codificante da subunidade maior ribossomal (LSU, de Large Subunit) para comparação e eventual confirmação dos resultados. Para ambas as regiões foram construídas árvores filogenéticas resultantes de análises Bayesiana e de Máxima Semelhança e, com base nos valores de suporte (Posterior Probability e Bootstrap) e nas distâncias genéticas encontradas entre os pares de sequências, foi reavaliada a posição de seis espécies dentro do género Corollospora e contribuiu-se para a resolução do complexo C. marítima. Surgirem ainda evidências para a constituição de cinco a seis novos géneros, também suportadas pela morfologia dos ascósporos desses organismos.The main purpose of this project was to characterize Corollospora maritima isolates (marine fungus belonging to the family Halosphaeriaceae) that are part of the FCUL collection, as well as new samples obtained from the Portuguese coast, in order to compare their genetic diversity with data from organisms of other geographic regions and evaluate if C. maritima is a case of cryptic speciation, hence hiding more than one species. The characterization of the samples was done by morphological evaluation and genetic analysis of sequences obtained from PCR products from DNAs amplified in the presence of primers specific to the ITS (internal transcribed spacer) region of the ribosomal nuclear DNA (including the spacer regions ITS1 and ITS2, and the gene 5.8S). The sequences obtained in this study, alongside sequences from the genus Corollospora available on the NCBI (National Center for Biotechnology Information) and NBRC (National Institute of Technology and Evaluation Biological Resource Center) databases, were subjected to phylogenetic and pairwise genetic distances analyses. Using the single spore methodology, two new isolates of C. maritima were obtained from drift culms collected in beaches from Cascais. The sequences from these new isolates, additionally to four C. maritima genomic sequences obtained from non-culturable environmental samples collected in beaches from three different regions of the Portuguese coast, integrated the sequences evaluated in this study. The morphological evaluations performed by macroscopic and microscopic characterizations, included isolates of the FCUL collection and the two new isolates after having been cultured in three different media. The microscopic characterization included all available C. maritima samples, including those that were part of the definitive microscopic preparations from the C. maritima isolates of the FCUL collection, and non-culturable environmental samples, besides the isolates growing in culture media. The first step of the genetic evaluation consisted in the checking of the new sequences through BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) on the NCBI database to verify if they belonged to C. maritima. These sequences, alongside others available on the databases, were subjected to an alignment, from which a pairwise distance matrix was generated. The first results suggested the convenience in performing partial alignments, each one involving one species or only the more related species evaluated in the present study. The pairwise distance matrix generated with the alignment only including all C. maritima ITS sequences revealed the presence of at least three species within this group: C. maritima, a species earlier identified as C. portsaidica, and a new species that we propose to designate as Corollospora pseudomaritima. The partial alignments also allowed to propose distance values that permit distinguishing between species and genus within the Halosphaeriaceae family. Furthermore, the partial alignment results allowed to select, when feasible, the two largest and more distant sequences within each group/species, to be submitted to the global/final alignment to go through pairwise distance and phylogenetic analyses (Bayesian and Maximum Likelihood trees). The first analysis targeted the ITS region, using the LSU (coding for the large subunit of the rRNA) region to compare and eventually confirm the results from the ITS region. For both regions, phylogenetic trees were built and, in view of their support values (Posterior Probability and Bootstrap) and pairwise distances, the position of six species within the Corollospora genus were questioned including the complex C. maritima, also highlighting the potential for five to six new genera, which are supported by morphological features of the ascospores