Using iPSCs-derived microglia from Alzheimer´s disease patients to assess early cell deficits and neurotoxic properties

Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa progressiva e irreversível mais comum, sendo caracterizada pela perda de memória, deficiência cognitiva e anomalias comportamentais. Como a maioria das doenças, esta patologia resulta de uma mistura de fatores genéticos e ambientais. A marca principal da DA é a secreção das formas amiloide-β (Aβ), e das placas senis associadas compostas por agregados de Aβ e outras proteínas misfolded. Tais anomalias podem ter uma base genética, como a existência de uma mutação quer na Proteína Precursora Amiloide (APP) quer na sua maquinaria proteolítica. Outra anormalidade é o ganho ou perda de função da presenilina 1 (PSEN1) ou 2 (PSEN2) que causa a DA familiar precoce. Por outro lado, a DA esporádica, apesar de não ter uma regra padrão pode estar relacionada, por exemplo, com uma mutação em Apolipoproteína E (APOE). Durante muitos anos, a hipótese da cascata amiloide foi a melhor teoria para explicar a fisiopatologia da DA. Por isso, é normal que as vias metabólicas envolvidas na formação de placas amiloides sejam objeto de múltiplos estudos. A DA não tem cura, a pesquisa continua, mas a doença ainda apresenta vários obstáculos à sua compreensão completa. Microglia, as células imunitárias inatas do sistema nervoso central são responsáveis por muitas funções para sustentar a homeostase cerebral, incluindo as envolvidas na resposta reparadora, a qual parece falhar na DA, nomeadamente em estádios avançados da doença. A microglia num estado estacionário exibe um fenótipo particular, caracterizado por ter um corpo celular de pequenas dimensões e ramificações que se estendem em todas as direções. Esta morfologia ramificada permite que a microglia monitorize o ambiente sem interferir com as atividades neuronais. Dependendo dos estímulos e do tempo de exposição, a microglia adquire várias modificações nos seus fenótipos. Estes fenótipos podem variar de inflamatórios e citotóxicos a mais pró-regenerativos, sendo na maioria dos casos uma mistura de fenótipos que são difíceis de descrever. Isto indica que a microglia ativada, disfuncional ou degenerativa pode contribuir de forma diferente para o início e progressão de tal desordem. Assim, torna-se crucial compreender a interação entre neurónios e células microgliais na doença de DA desde o seu início. No entanto, o cérebro humano é uma estrutura altamente complexa que não pode ser facilmente explorada in vivo e tem-se revelado difícil de modelar in vitro. Muitos dos modelos (linhas de células humanas e animais, invertebrados, peixe-zebra e modelos de animais roedores) representam momentos chave na compreensão do cérebro humano e nas interações celulares entre vários tipos de células. O isolamento da microglia a partir de tecidos post-mortem ou amostras cirúrgicas pode introduzir artefactos técnicos. Como resultado, modelos celulares recentes gerados a partir de células somáticas do paciente, utilizando a tecnologia de reprogramação de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC) forneceram ferramentas promissoras para compreender os mecanismos da doença humana, incluindo a DA. Neste trabalho, pretendíamos desenvolver um modelo humano capaz de recapitular o potencial patológico da microglia, ultrapassando assim as diferenças específicas das espécies e permitindo a aplicação na clínica. Para isso, usámos a microglia derivada de iPSCs de indivíduos saudáveis (controlo) e de doentes AD com mutações na presenilina 1 (PSEN1) e na Swedish (Swe), primeiro pela sua diferenciação a partir de iPSCs em EMPs e depois em microglia primitiva, geradas na University of Eastern Finland pela Profª Tarja Malm. Como as células eritromielóides (EMPs) podem ser congeladas, foram essas que nos foram enviadas e maturadas no nosso laboratório durante 2 dias até atingir o estádio de maturação própria para os estudos que realizámos - microglia induzida (iMicroglia). O método na sua globalidade é conseguido de forma relativamente rápida (apenas 24 dias), requerendo poucos reagentes quando comparados com outros e sendo relativamente fácil. Foi também usado um controlo isogénico, derivado do mesmo doente com mutação PSEN1, mas onde se fez a correção da mesma. A capacidade de trabalhar com iMicroglia diferenciada de iPSCs dos pacientes com DA abre espaço para uma melhor compreensão da doença e para o desenvolvimento de novas estratégias clínicas. As dificuldades surgem da heterogeneidade muitas vezes elevada da população de células que se obtém, da diferente maturação funcional e da especificidade regional. Após maturação as células foram caracterizadas por marcadores específicos e associados à microglia. De seguida, investigámos alterações na expressão de marcadores reativos e miRNAs associados a inflamatórios (miRNAs) em todas as linhas celulares diferenciadas e num controlo isogénico em que o gene PSEN1 foi corrigido (ISO PSEN1). Neste trabalho demonstrámos que a iMicroglia pode ser gerada de forma eficiente a partir de iPSCs seguindo um protocolo definido. É importante notar que a iMicroglia mostrou os habituais marcadores de microglia com base na expressão genética e dados proteicos da imunofluorescência, ao mesmo tempo que revelou a capacidade fagocítica. Testámos a capacidade fagocítica da iMicroglia gerada, uma vez que um dos problemas apontados à microglia no caso da AD é a sua ineficiência na eliminação das placas Aβ. Como esperado, a iMicroglia espontaneamente fagocitou as beads fluorescentes. Também identificámos alterações na morfologia celular das diferentes linhas celulares, os resultados não demonstraram diferenças entre o Controlo e as mutações PSEN1 e Swe em relação ao seu perímetro ou ao diâmetro de Feret. No que diz respeito à área, enquanto as células Swe mostraram um aumento na área celular, as ISO PSEN1 mostraram uma ligeira redução vs. Controlo. Analisámos ainda a expressão de marcadores celulares na iMicroglia que estão atualmente ligados à neuroinflamação e relacionados com o comportamento celular em AD, e.g., iNOS, CX3CR1, TREM2, MFGE8 e Arg1, na microglia PSEN1. Algumas destas alterações desapareceram na linha ISO PSEN1. Os resultados demonstram uma deficiência geral da maquinaria fagocítica e inflamatória, especialmente em iMicroglia PSEN1. Certos marcadores celulares eram mais notórios após a ativação das células com o interferão (IFN)-γ e com o lipopolissacarídeo (LPS). No que diz respeito aos miRNAs, observámos uma sobre-expressão de miRNA (miR)-146a e miR-21 em células com mutações Swe e PSEN1, relativamente ao controlo, enquanto nas isogénicas todos os miRNAs foram encontrados elevado e a área celular reduzida por provável manipulação genética. A iMicroglia PSEN1 revelou Arg1baixo, TREM2baixo e MFGE8alto, e após estimulação com IFN-γ + LPS, manteve Arg1baixa e MFGE8alta, mas iNOSalto. A estimulação causou miR-125balto nas células Swe e PSEN1, mas não nas ISO PSEN1. Assim, as mutações Swe e PSEN1 desregulam os marcadores de polarização microglial tanto antes, como após estimulação com IFN- γ + LPS. As células ISO PSEN1 mostraram aumento de Arg1 e MFGE8, e diminuição de iNOS e de miR-146a, após estimulação relativamente às não estimuladas, mantendo a sua capacidade funcional. O nosso estudo foi inovador na identificação de alterações na assinatura inflamatória microglial em subpopulações de doentes com AD familiar, as quais podem ajudar na estratificação dos doentes. Serviu também para evidenciar que a correção isogénica apenas restaura parte do fenótipo saudável, enquanto exacerba a expressão dos miRNAs inflamatórios. Outra descoberta importante e pioneira foi a de que os miRNAs nas células Swe e PSEN1 não respondem a estímulo adicional e nas ISO PSEN1 até os regulam negativamente. Obtivemos muitos resultados heterogéneos em termos de marcadores e miRNAs, que também observados noutros estudos, reforçando que os pacientes com DA têm assinaturas inflamatórias específicas, e por isso, beneficiariam muito de uma medicina individualizada. Em conclusão, os resultados obtidos para a microglia derivada dos iPSCs, apesar de promissores deverão ser complementados com mais estudos de modo a fomentar os esforços no combate à DA. A possibilidade de revitalização da microglia disfuncional pode ser mais importante que os sucessivos compostos anti-inflamatórios propostos que sistematicamente falharam ou pioram a progressão da DA do paciente.Alzheimer’s disease (AD) is the most common, progressive, and irreversible neurodegenerative disorder is characterized by memory loss, cognitive impairment, and behavioural abnormalities. As most of the diseases, this pathology results from a mixture of genetic and environmental factors. The major mark of AD is the secretion of Amyloid-β (Aβ) forms, and the associated senile plaques composed of aggregated Aβ and other misfolded proteins. Such abnormalities may have a genetic basis, as the existence of one mutation either in Amyloid Precursor Protein (APP) or in its proteolytic machinery. Other abnormality is the gain or loss of function of presenilin 1 (PSEN1) or 2 (PSEN2) that causes early onset familial AD. On the other hand, the sporadic AD, despite not having a standard rule may be related, for example, with a mutation in Apolipoprotein E (APOE). During many years, the amyloid cascade hypothesis was the best theory to explain AD pathophysiology. So, it is normal that the metabolic pathways involved in the formation of amyloid plaques are the object of multiple studies. AD has no cure, the research continues, but the disease still presents several obstacles to its full understanding. Microglia, the innate immune cells of the central nervous system are responsible for many functions to sustain brain homeostasis, including those involved in the reparative response, which seems to fail in AD, namely in advanced stages of the disease. Steady-state microglia exhibit a particular phenotype, characterized by having a cellular body of small dimensions and ramifications that extend in all directions. This ramified morphology allows microglia to scan the environment, without interfering with neuronal activities. Depending on the stimuli and the time of exposure, microglia acquire several modifications in their phenotypes. These phenotypes can vary from inflammatory and cytotoxic to a more pro-regenerative one, being in most cases a blend of phenotypes that are hard to describe. This indicates that the activated, dysfunctional, or degenerative microglia may differently contribute to the onset and progression of such disorder. So, it becomes crucial to understand the interplay between neurons and microglial cells in the AD disease from its onset. However, human brain is a highly complex structure that cannot be easily explored in vivo and has proven difficult to model in vitro. Many of models (human and animal cell lines, as well as invertebrate, zebrafish, and rodent animal models) represent key events in human brain and cell-cell interactions understanding. The isolation of microglia from post-mortem tissue or surgery specimens may introduce technical artefacts, and the impact of confounding factors. As a result, recent cellular models generated from patient somatic cells by using the induced pluripotent stem cell (iPSC) reprogramming technology. Here, we aimed to develop a human model able to recapitulate the pathological potential of AD microglia, thus surpassing species-specific differences and allowing translation to clinic. For that, iPSC derived microglia from healthy (control) and AD individuals with Presenilin 1 (PSEN1) and Swedish (Swe) mutations were obtained by first differentiating iPSCs into EMPs and then into primitive microglia at the University of Eastern Finland by Profª Tarja Malm. As the erythromyeloid cells (EMPs) can be frozen, they were sent to us and matured in our laboratory for 2 days until reaching the stage of maturation proper for the studies we carried out - induced microglia (iMicroglia). The method as a whole is achieved relatively quickly (only 24 days), requiring few reagents when compared to others and being relatively easy. An isogenic control was also used, derived from the same patient with PSEN1 mutation, but where the correction was made. The ability to work with iMicroglia differentiated from iPSCs of patients with AD opens space for a better understanding of the disease and for the development of new clinical strategies. The difficulties arise from the high heterogeneity of the cell population that is obtained, the different functional maturation and regional specificity. After maturation, the cells were characterized by specific markers and associated with microglia. Then, we investigated changes in the expression of reactive markers and inflammatory-associated miRNAs (miRNAs) in all differentiated cell lines and in an isogenic control in which the PSEN1 gene was corrected (ISO PSEN1). In the present work we demonstrated that iMicroglia can be efficiently generated from iPSCs following a defined protocol. It is important to note that iMicroglia showed the usual microglia markers based on the gene expression and immunofluorescence protein data, while also revealed phagocytic ability. We tested the phagocytic capacity of the generated iMicroglia, since one of the problems pointed out to the microglia in the case of AD is its inefficiency in clearing the Aβ plaques. As expected, the iMicroglia spontaneously phagocytosed the fluorescent latex beads. We also identified changes in cell morphology of the different cell lines, results demonstrated no differences between the Control and PSEN1 or Swe mutation in relation to their perimeter or Feret's diameter. Regarding the area, while Swe mutated cells showed increase in cell area, ISO PSEN1 showed a reduction vs. Control line. We additionally analysed the expression of cellular markers in iMicroglia that have currently been linked with neuroinflammation and related with cell behaviour in AD, e.g., iNOS, CX3CR1, TREM2, MFGE8 and Arg1, in the PSEN1 microglia. Some of these alterations disappeared in the ISO PSEN1 line. Results demonstrate an overall deficiency of the phagocytic and inflammatory machinery, especially in PSEN1 iMicroglia. Certain cell markers were more notorious after activation with inflammatory stimuli, such as interferon (IFN)-γ and lipopolysaccharide (LPS). In what concerns miRNAs, we observed an overexpression of miRNA (miR)-146a and miR-21 in cells bearing Swe and PSEN1 mutations, when compared to control, while isogenic cells showed overexpressed miRNAs, probably due to the genetic manipulation, together with a low mean cell area. The naïve PSEN1 iMicroglia revealed Arg1low, TREM2low and MFGE8high, and when stimulated with IFN-γ + LPS, the signature was still Arg1low and MFGE8high, but this time with iNOShigh, as well. Inflammatory stimuli led to miR-125bhigh in Swe and PSEN1 cells, but not in ISO PSEN1 ones. Thus, Swe and PSEN1 mutated iMicroglia show deregulated polarized markers before and after IFN-γ + LPS stimulation. When stimulated, ISO PSEN1 iMicroglia showed higher Arg1 and MFGE8, together with lower iNOS and miR-146a, relatively to the matched naïve cells, suggesting sustaining of functional capacity. Our study was innovative in identifying changes in inflammatory microglia signature in familiar AD patient subpopulations that may help in their stratification, and in highlighting that isogenic correction only restore some of steady-state microglia markers, while exacerbate inflamma-miRNAs. A pioneer finding was to observe that Swe and PSEN1 cells were not able to respond to an additional stimulus, sustaining the inflamma-miRNA profiling, while ISO PSEN1 appear to have a machinery to suppress further priming. We obtained many heterogeneous results in terms of markers and miRNAs, also observed in other studies, reinforcing that patients with AD have specific inflammatory signatures thus benefiting from precision medicine. In conclusion, while promising, iPSCs-derived microglia deserve to be further studied to push forward our efforts to combat AD. Indications on the revitalization of such non-functional microglia may be more important that simply propose anti-inflammatory compounds that have systematically failed or even worse the patient AD progression