Study of biomarkers in Multiple Myeloma: a statistical approach for longitudinal assessment of extracellular vesicles and its prognostic value

Trabalho de projeto de mestrado em Bioestatística, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2021O Mieloma Múltiplo (MM) é um cancro hematológico que tem origem na proliferação de células plasmáticas clonais que se acumulam na medula óssea e segregam imunoglobulinas monoclonais (mIg). Esta proliferação é acompanhada pela diminuição da função da medula óssea e pela destruição do tecido ósseo (Mangan, 2005). O MM é quase sempre precedido por dois estádios de doenças: MGUS (Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance) e de um estádio intermédio/indolente denominado SMM (Smoldering Multiple Myeloma). Nestes estádios, nenhuma das características que definem o MM está presente e os doentes requerem apenas vigilância médica periódica (Ho et al., 2020). Na maior parte dos casos, o doente é diagnosticado a partir de análises laboratoriais, uma vez que os sintomas só começam a surgir numa fase mais tardia. No entanto, o diagnóstico final é realizado através de aspiração e biópsia de medula óssea. Estes testes, apesar de invasivos, são considerados gold standard para o diagnóstico, uma vez que permitem a quantificação dos plasmócitos clonais na medula óssea. Contudo, não existe ainda na prática clínica outro teste disponível que seja menos agressivo e que o substitua. Atualmente, o Revised International Staging System (R-ISS) (Palumbo et al., 2015) é o modelo usado como base para a determinação do prognóstico de doentes MM recentemente diagnosticados, correspondendo a um score de agressividade de doença. Através de uma escala de três níveis, este modelo de estratificação de risco determina quais os doentes com melhor prognóstico, intermédio e pior. Apesar dos constantes avanços a que se assiste no campo do MM, doentes que aparentemente têm prognósticos semelhantes acabam por apresentar desfechos bastante heterógeneos. Isto indica que os mecanismos atuais, embora úteis, falham na determinação de um prognóstico preciso. De forma a encontrar novos biomarcadores séricos desta doença que permitam um acompanhamento constante do prognóstico do doente de forma menos invasiva, têm sido estudados novos métodos utilizando biópsias líquidas (Ferreira et al., 2020). Este tipo de biópsia permite obter informação sobre a doença a partir de amostras sanguíneas utilizando uma técnica minimamente invasiva. É neste contexto que surge o estudo de vesículas extracelulares, em particular de exosomas. Os exosomas são partículas com um diâmetro entre 30 e 100 nanómetros, produzidos por vários tipos de células e secretadas por estas para o microambiente extracelular. Sabe-se que têm várias funções e estão envolvidos em diversos processos celulares, alguns patológicos, como a transformação de células saudáveis em células malignas, bem como na indução do nicho pré-metastático (Kawano et al., 2015). Existem já vários estudos que demonstram que os exosomas isolados a partir do sangue periférico de doentes com MM podem servir como marcadores de diagnóstico e predição de progressão de doença, uma vez que os exosomas refletem a grande parte das propriedades das células que lhes deram origem (Moloudizargari et al., 2019); neste caso, das células tumorais. Neste estudo, cuja mediana do tempo de observação ronda os 2 anos, foram sendo colhidas prospectivamente amostras de 102 doentes diagnosticados e/ou tratados no centro clínico da Fundação Champalimaud (Lisboa, Portugal) que foram diagnosticados à entrada no estudo com MM ou outra gamapatia monoclonal (MGUS ou SMM). O objetivo principal deste estudo foi a validação das vesículas extracelulares, não só enquanto biomarcador de prognóstico, mas também enquanto mecanismo de monitorização e acompanhamento regular dos doentes na prática clínica. A avaliação destas vesículas extracelulares foi desenvolvida por intermédio da variável EVs Cargo (Extracellular Vesicles Cargo). Esta variável corresponde ao rácio entre a concentração proteica e a concentração das partículas (μg/108 partículas) e, até agora, nunca antes tinha sido estudada neste âmbito, uma vez que habitualmente representa apenas uma medida de pureza, demonstrando a eficiência dos protocolos de isolamento. As variáveis de interesse incluíram variáveis demográficas tais como a idade, o género, o diagnóstico à entrada no estudo, os scores de agressividade de doença (para MGUS, SMM e MM), a sequência cronológica em que as amostras foram colhidas, bem como o número de linhas de tratamento previamente realizadas em cada colheita de amostra, mas também variáveis laboratoriais, tais como os níveis de IgG, IgA e IgM, os níveis de sFLC kappa e lambda, o nível do rácio sFLC, bem como os níveis de LDH, hemoglobina, neutrófilos, plaquetas, beta-2-microglobulina, creatinina, albumina e proteína-C reactiva. Estas variáveis foram selecionadas tendo em conta o seu impacto e relevância clínica, de acordo com a literatura existente. A sobrevivência global foi definida como o tempo, em meses, desde a entrada no estudo até morte por qualquer causa. Doentes que não manifestavam o outcome de interesse à data do último follow-up conhecido foram censurados nessa data. Numa fase inicial, através das estimativas de Kaplan-Meier das funções de sobrevivência global, foi possível verificar que, à entrada no estudo, a coorte estudada assume as mesmas características das já demonstradas e verificadas pela literatura. Nomeadamente, foi possível observar que doentes MGUS apresentam uma probabilidade de sobrevivência superior a doentes SMM e MM, e que doentes SMM apresentam uma probabilidade de sobrevivência superior a MM. Contudo, aproximadamente a partir da mediana do tempo de estudo, doentes SMM revelam pior sobrevivência do que doentes MM. Por outro lado, focando-nos nos doentes MM, verificou-se que, não só existem diferenças relativamente à sobrevivência global dos doentes consoante o nível R-ISS, mas também que o prognóstico piora progressivamente ao longo da escala R-ISS (Palumbo et al., 2015). Finalmente, foi também observado que os doentes que, à entrada no estudo, tivessem já realizado alguma linha de tratamento, apresentam pior prognóstico, sendo que este piora com o aumento do número de linhas de tratamento. Esta observação é concordante com o publicado por Kumar et al. (2004). Na primeira fase deste projeto foi testada a associação da variável de interesse (EVs Cargo) com a sobrevivência global dos doentes, à altura da inclusão no estudo. Contudo, face à não validação dos pressupostos necessários à aplicação de modelos de regressão de Cox, esta variável foi categorizada tendo como base uma metodologia direcionada especificamente para o outcome pretendido: neste caso, a sobrevivência global. Através desta metodologia, foi possível obter um ponto de corte ótimo, que nos permitiu categorizar a variável EVs Cargo em dois grupos: EVs Cargo Low (≤ 0.6 μg/108 partículas) e EVs Cargo High (> 0.6 μg/108 partículas), com uma diferença significativa entre estes dois grupos relativamente à sobrevivência global. De forma interessante, através das estimativas de Kaplan-Meier das funções de sobrevivência global foi também possível observar que, apesar de doentes MM (independentemente do nível EVs Cargo) apresentarem sempre pior prognóstico do que doentes SMM, com o passar do tempo, doentes SMM com EVs Cargo High passam a apresentar pior prognóstico do que qualquer uma das categorias de MM. Este resultado pode ser indicador da necessidade de tratamento de doentes SMM de alto risco: devido ao facto destes doentes não serem tratados, doentes SMM de risco elevado acabam por apresentar, ao longo do tempo, um pior prognóstico do que doentes MM, para qualquer um dos níveis de EVs Cargo. Em seguida, tendo em conta a estratificação da variável EVs Cargo, foi desenvolvido um modelo longitudinal que nos permitiu avaliar a significância de alguns fatores na explicação de doentes que, ao longo do tempo, manifestam EVs Cargo High. O que se observou foi que os doentes que ao longo do tempo manifestam níveis reduzidos de IgA bem como níveis elevados de sFLC lambda e um reduzido tempo em resposta (caracterizado pelo tempo entre linhas de tratamento) são doentes que têm maiores chances de apresentar EVs Cargo High e, em consequência, um pior prognóstico. A qualidade do ajustamento do modelo proposto foi verificada pela curva ROC e pela respetiva AUC. Por último, e através da análise diferencial da expressão proteica entre os diversos níveis das variáveis selecionadas como significativas no modelo proposto, foi possível validar os resultados e conclusões obtidos pelo modelo. Para a validação final enquanto biomarcador de prognóstico, foi feita também a comparação entre doentes e dadores saudáveis ao nível da expressão proteica. Esta foi a primeira vez que vesículas extracelulares provenientes de doentes com gamapatias monoclonais foram analisadas usando um estudo clínico observacional, no qual a evolução natural da doença foi sendo seguida ao longo do tempo. Através deste estudo foi possível verificar que, não só as vesículas extracelulares têm potencial para serem usadas como biomarcadores no contexto do MM, como também que a variável EVs Cargo em particular reúne todas as condições para que possa ser usada enquanto variável de prognóstico e como mecanismo de avaliação periódica dos doentes. A utilização desta variável enquanto biomarcador nunca antes tinha sido testada. Embora estes resultados careçam de validação numa coorte maior, seguida durante mais tempo, creio que as conclusões obtidas com este estudo têm uma enorme relevância translacional e que podem, futuramente, constituir uma forma de prognóstico e acompanhamento constante das alterações no estado clínico dos doentes.Over the years there have been significant improvements in the oncological field. We are currently moving towards a more patient-oriented medicine, aiming at constant monitoring and follow-up of the evolution of each patient’s condition. In the particular case of MM, we know that patients with similar prognoses may present heterogeneous outcomes. This indicates that the current prognostic mechanisms, although useful, are not sufficiently precise. In this sense, the study of extracellular vesicles emerges as a prognostic and follow-up mechanism of patients. In this project, based on a total of 102 patients monitored over a median period of, approximately, 2 years and using the variable EVs Cargo (protein:particle ratio) as representative of extracellular vesicles, we could prove that, at study entry, patients presenting EVs Cargo > 0.6 μg/108 particles (high risk) have a significantly worse prognosis than patients with EVs Cargo ≤ 0.6 μg/108 particles (low risk). Furthermore, it was possible to observe that high-risk SMM patients have, over time, a worse prognosis than low-risk MM patients and, to some extent, even worse than high-risk MM patients. On the other hand, and taking into account the established cut-off, it was possible to verify that patients who, over time, manifest a depletion of IgA levels, high levels of sFLC lambda and a short time in response have increased odds of presenting high levels of EVs Cargo and, consequently, a worse prognosis. The quality of the adjustment of the model was verified by the ROC curve and the AUC measurement. Furthermore, the validity of the results obtained was verified by the analysis of differential protein expression between the levels of the variables included in the model, but also by protein comparison between healthy donors and patients. Through this complete approach, it was possible not only to validate the EVs Cargo as a prognostic biomarker but also as a follow-up mechanism of patients throughout the natural course of their disease. Further studies with a longer follow-up period and a different cohort of patients are needed to confirm our results. If these results are validated, this could be a new tool to be used as the first alarm signal of the deterioration of the patient’s health condition, allowing more thorough examinations in such cases