Sensitivity profile of triple-negative breast cancer cell lines to combination therapies including RANKL blockade

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020O cancro da mama (CM) é o cancro com a segunda mais elevada mortalidade a nível mundial. Dada a heterogeneidade que apresenta, é classificado em subtipos de acordo com a expressão de determinados recetores moleculares, de modo a permitir uma maior especificidade, e consequentemente eficácia, no tratamento dos pacientes. Um dos subtipos definidos é o CM triplo negativo (TNBC, do inglês triple- -negative breast cancer), caraterizado pela ausência de expressão de recetores de progesterona (RP) e de recetores de estrogénio (RE), e ainda por não apresentar amplificação do recetor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). O TNBC constitui cerca de 10% a 15% dos casos de CM e está associado a um prognóstico pior do que os restantes subtipos, possuindo os pacientes taxas de sobrevivência inferiores e maior probabilidade de recidiva. Apesar de o TNBC apresentar uma elevada sensibilidade à quimioterapia, sendo esta a terapia padrão para os doentes com TNBC, a aquisição de mecanismos de resistência explica as recidivas e pior prognóstico observados. Deste modo, é necessária a investigação de novas abordagens clínicas direcionadas que reduzam o impacto negativo do TNBC na sociedade. Os inibidores da poli-(ADP-ribose) polimerase (PARP) (iPARP) são uma classe de fármacos que afeta a reparação de quebras simples da cadeia de DNA (SSB, do inglês single strand breaks). Em paralelo, CM com mutações nos genes BRCA1 e/ou BRCA2 tendem a perder o alelo saudável, o que lhes confere deficiência na reparação por recombinação homóloga (HRR, do inglês homologous recombination repair), impedindo a correção de quebras duplas da cadeia de DNA (DSB, do inglês double strand breaks). Estes dois défices resultam eventualmente em apoptose. O olaparib é um iPARP aprovado para tratamento de CM, nomeadamente em doentes com CM HER2- metastático ou avançado com mutações germinais em BRCA1/2 e de doentes com CM com recetores hormonais (RH) não responsivos a terapia hormonal (TH). É possível que outros doentes com TNBC beneficiem do olaparib, particularmente com tumores possuindo mutações somáticas em BRCA1/2 ou metilação do promotor destes genes. Por outro lado, os inibidores da fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K) (iPI3K) são fármacos que atuam ao nível da via do PI3K/Akt/mTOR, que é uma via de sinalização frequentemente mutada em CM, incluindo TNBC. Enquanto que o PI3K promove a ativação da quinase Akt, a fosfatase homóloga à tensina (PTEN) regula negativamente este processo, estando associada a funções de supressão tumoral. Recentemente, foi aprovado um iPI3K, o alpelisib, para tratamento de doentes com CM RE+, RP+, HER2- metastático ou avançado com mutações no gene PIK3CA e após progressão sob TH. Este inibidor apresenta especificidade para a isoforma α do PI3K, cuja subunidade catalítica é codificada pelo gene PIK3CA, e atua através de um mecanismo pró-apoptótico. É possível que o alpelisib tenha utilidade no tratamento de doentes com TNBC com mutações ao nível do PIK3CA. Curiosamente, foi previamente descrita uma sinergia entre iPARP e iPI3K em modelos de TNBC, o que levou a um ensaio clínico que pretendeu testar a combinação de olaparib com os iPI3K buparlisib ou alpelisib em doentes com TNBC recorrente ou cancro ovárico seroso de alto grau. Este ensaio demonstrou existir sinergia entre olaparib e alpelisib em cancro ovárico HRR-competente. O mesmo poderá ser verdade para TNBC BRCA-competente, e talvez especialmente em doentes com mutações no PIK3CA. O ligando do recetor ativador do fator nuclear kappa B (RANKL) é uma proteína homotrimérica pertencente à superfamília dos fatores de necrose tumoral (TNF, do inglês tumour necrosis factors) e que pode existir na forma membranar ou solúvel. O RANKL liga-se ao recetor RANK, um recetor homotrimérico transmembranar que requer proteínas adaptadoras para ser funcional. Destas, destaca-se o fator associado a TNF 6 (TRAF6), que tem um envolvimento crucial na ativação de vias a jusante de RANKL/RANK, nomeadamente as vias do PI3K/Akt/mTOR, das proteínas quinases ativadas por mitogénios (MAPKs), e da Src/fosfolipase gamma (PLCγ). Esta cascata de transdução de sinal resulta na promoção da sobrevivência, diferenciação e proliferação celulares devido à translocação nuclear de ativadores transcricionais, nomeadamente o NF-κB. A via de sinalização RANKL/RANK é negativamente regulada pela osteoprotegerina (OPG), um recetor “engodo” que é capaz de se ligar ao RANKL com uma afinidade largamente superior à que o RANK apresenta. A via do RANKL/RANK está envolvida em diversos processos fisiológicos, sendo de ressalvar a importância crucial na manutenção da homeostase óssea. Uma outra função crítica desta via ocorre ao nível do tecido mamário, nomeadamente promovendo a morfogénese da glândula mamária durante a gravidez. A progesterona possui um efeito mitogénico nas células epiteliais mamárias, ligando-se ao RP de células epiteliais luminais e promovendo um aumento da expressão de RANKL. Esta citocina vai interagir com células RANK+, tanto basais como luminais, e promover fenómenos de proliferação e sobrevivência. De destaque, há duas cascatas de sinalização envolvidas neste processo, uma resultando na transcrição da ciclina D1 dependente do NF-κB, e outra resultando na redução da transcrição da p21 mediada pelo inibidor da proteína DNA binding 2 (Id2). No contexto oncológico, já foi observada expressão de RANK e RANKL em diversos tumores humanos e, inclusive, foram propostas associações preditivas de mau prognóstico. O envolvimento da via RANKL/RANK neste contexto foi já descrito ao nível da promoção da transição epitélio-mesênquima (TEM), migração celular, neovascularização tumoral, estabelecimento de metástases à distância, imunossupressão, entre outros. Um dos cancros em que foi estabelecida uma relação entre esta via e a carcinogénese é o CM – tendo sido destacado o envolvimento da progesterona e derivativos sintéticos. Para além disso, foi ainda identificado o papel crucial do eixo progesterona/RANKL na tumorigénese de CM com mutações em BRCA1, que são maioritariamente TNBC. Ainda no contexto do CM, a via RANKL/RANK está por detrás do ciclo vicioso que se observa frequentemente nas metástases ósseas, em que ocorre uma promoção descontrolada da reabsorção óssea, criando no osso um nicho favorável ao estabelecimento das células tumorais. A via RANKL/RANK é, deste modo, um alvo terapêutico emergente tanto ao nível do TNBC como do CM no geral. Entre 2010 e 2011, foi aprovado para utilização clínica um anticorpo monoclonal anti- -RANKL totalmente humanizado, denosumab, sendo atualmente utilizado em doentes com CM sob terapia de ablação hormonal e em contexto de doença metastática óssea. Tendo sido previamente observado um efeito do bloqueio do RANKL in vitro na prevenção da tumorigénese de CM mutado em BRCA1, é possível que este bloqueio se possa demonstrar vantajoso em TNBC quando integrado em abordagens terapêuticas combinatórias. Neste projeto, colocámos a hipótese de que a inibição farmacológica da via RANKL/RANK, através do bloqueio do RANKL, poderia apresentar sinergia com iPARP, como o olaparib, e/ou iPI3K, como o alpelisib, no contexto do TNBC. Considerando que o TNBC pode expressar RANK e RANKL, e que uma maior expressão destas proteínas poderá estar associada a uma maior suscetibilidade ao bloqueio por RANKL, começámos por avaliar a expressão de ambas num painel de linhas celulares TNBC (BT-20, HCC1937, MDA-MB-231 e MDA-MB-468). De seguida, de modo a justificar uma abordagem de inibição da via RANKL/RANK, foi confirmada a ativação da via por RANKL exógeno, nomeadamente a fosforilação de proteínas a jusante da via como p-65, Erk e Akt. Para realizar o bloqueio do RANKL, foi selecionada a proteína recombinante OPG-Fc, que confirmámos ser capaz de inibir a ativação da via pelo RANKL. Estando verificada a possibilidade da abordagem inibitória, foram primeiramente realizados ensaios de viabilidade celular após 72 horas de exposição a olaparib, alpelisib e OPG-Fc, em regime individual. As diferentes linhas celulares mostraram-se, na sua maioria, resistentes ao olaparib, mas sensíveis ao tratamento com alpelisib, embora a diferentes níveis. A OPG-Fc não mostrou afetar, per se, a viabilidade celular. Finalmente, de modo a verificar o efeito do bloqueio do RANKL quando em combinação com olaparib e/ou alpelisib, foram realizados ensaios de viabilidade envolvendo combinações duplas de olaparib e OPG-Fc ou alpelisib e OPG-Fc; e combinações triplas de olaparib, alpelisib e OPG-Fc. Nenhuma das referidas combinações se mostrou significativamente vantajosa em termos de redução da viabilidade celular quando comparados os regimes com e sem OPG-Fc. Foi confirmado por análise de expressão proteica que o olaparib e o alpelisib estavam, de facto a afetar os respetivos alvos moleculares, confirmando-se assim que a adição de OPG-Fc não foi eficaz no contexto das células TNBC avaliadas. Apesar dos resultados obtidos, a inibição da via do RANKL/RANK continua a ser um alvo terapêutico importante no âmbito do TNBC, existindo evidências pré-clínicas de sinergia do bloqueio do RANKL com inibidores de checkpoints do sistema imunitário.Triple-negative breast cancer (TNBC) accounts for around 10% to 15% of breast cancer (BC) cases and is typically associated with bad clinical outcomes. Chemotherapy is the current standard of care for this complex disease. However, high likelihood of relapse is observed due to acquired chemoresistance. Moreover, TNBC also strikingly lacks effective targeted therapies. These aspects highlight the critical importance of research on new and innovative approaches to treat these patients. Combination therapies are quite pertinent for drug research on clinically relevant alternatives. Namely, they may allow drug repurposing for faster yet effective translation into the clinical practice and also permit the administration of lower drug dosages, thus reducing side effects. The receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL)/RANK pathway became an emerging target in this context after being linked to TNBC tumorigenesis. This pathway is involved in cell proliferation and survival mainly through downstream activation of the NF-κB, phosphoinositide 3- -kinase (PI3K)/Akt/mammalian target of rapamycin (mTOR) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. Furthermore, dual RANKL and RANK expression was associated with worse prognosis amongst TNBC patients when compared to TNBC presenting RANK single expression. Here, we describe the impact of a combination regimen including RANKL blockade with osteoprotegerin (OPG)-Fc and poly (adenosine diphosphate-ribose) polymerase (PARP) inhibition with olaparib and/or PI3K inhibition with alpelisib in TNBC cell lines BT-20, HCC1937, MDA-MB-231 and MDA-MB- -468. The cell line panel was initially characterised according to RANK and RANKL expression. Following exogenous RANKL stimulus, we verified pathway activation, which was successfully abrogated upon OPG-Fc treatment. We report no statistically significant impact on cell viability associated with combination therapies including RANKL blockade, PARP inhibition and/or PI3K inhibition in vitro in the TNBC cell lines. Nonetheless, despite the lack of synergy observed in the selected combinations, RANK signalling remains an important target in TNBC patients, with reports of pre-clinical success with other drug types, namely immune checkpoint inhibitors