Estudio topológico del ADN nucleosomal y su paradoja del número de enlace

El empaquetamiento del ADN en fibras de cromatina implica una gran cantidad de deformaciones geométricas de la doble hélice (enrollamiento y superenrollamiento del ADN) y la formación de una jerarquía de asas o dominios de distinto tamaño. Este empaquetamiento conlleva severas restricciones topológicas, las cuales juegan un papel determinante en los procesos metabólicos del ADN. Sin embargo, la arquitectura fina de la cromatina en 3D/4D, así como la trayectoria espacial y la topología de las cadenas de ADN a través de cada elemento individual de la cromatina, permanecen como aspectos enigmáticos y poco explorados. Ello es debido tanto a limitaciones metodológicas como a su dificultad conceptual, que hacen de la topología del ADN un área de estudio casi desconocida para gran parte de la comunidad científica. En los años 80, diversos estudios experimentales establecieron que la unidad estructural de la cromatina, el nucleosoma, estabilizaba una diferencia del número de enlace (∆Lk) igual a -1.0/por nucleosoma. Este valor, sin embargo, suponía una incongruencia respecto al valor teórico estimado a partir de otros estudios estructurales de los nucleosomas, que concluían que el valor ∆Lk debería ser > -1.0 y cercano a -2. Esta incongruencia generó la llamada “Paradoja del número de enlace del ADN nucleosomal”, que ha estado vigente hasta la actualidad. En esta tesis se ha realizado un minucioso análisis de la topología del ADN nucleosomal para determinar con precisión el valor ∆Lk. Los resultados presentados demuestran que los nucleosomas estabilizan un valor medio de ∆Lk = -1.26. Este valor, junto a las correcciones de los valores teóricos derivados de los estudios estructurales previos, soluciona la paradoja del número de enlace del ADN nucleosomal. La aproximación metodológica, utilizando pequeños minicromosomas circulares para el análisis topológico de elementos de la cromatina in vivo, hace del presente trabajo una apuesta novedosa y original en el campo de la topología.Packaging of DNA molecules into chromatin imposes severe geometrical deformations and topological constraints in the double helix (DNA wrapping, looping and supercoiling). These restrictions play an important role in the regulation of genome activities. Whereas the 3D/4D architecture of chromatin is being uncovered down to Kb resolution, the local path and the topology of the DNA strands constrained by individual chromatin elements remains elusive due to methodological limitations and conceptual complexity. In the ‘80s, it was established that the structural unit of chromatin, the nucleosome, constrains on average about one negative DNA supercoil (i.e. a DNA linking number difference, ∆Lk, of -1/ per nucleosome). However, this ∆Lk value was inconsistent with the theoretical value estimated from structural studies (∆Lk ≈ -2). This incongruence between the theoretical and the experimental value produced the so-called “linking number paradox”. In this thesis, we developed an approach to analyze the topology of DNA constrained by individual chromatin elements in vivo, so we could accurately determine the ∆Lk value stabilized by individual nucleosomes. Our result indicates that nucleosomes stabilize an average value of ∆Lk = -1.26. This value balances the twist (∆Tw ≈ +0.2) and writhe (∆Wr ≈ -1.5) deformations of nucleosomal DNA in terms of the equation ∆Lk = ∆Tw + ∆Wr. Our finding could solve the long standing “linking number paradox” of nucleosomal DNA