Structural and functional analysis of Zika Virus NS5 protein

Zika virus (ZIKV) belongs to the Flaviviridae family and constitute an important public health concern since ZIKV infection produced devastating effects in new born infants. Flaviviruses present a positive sense single stranded RNA genome flanked by highly structured untranslated regions (UTR) carrying one open reading frame that codifies for three structural proteins (C, prM, E) and five nonstructural proteins (NS1-5). At the most C-terminal end, NS5 protein carries a RNA dependent RNA polymerase (RdRP) and a methyl transferase domain (MTase) for genome copying and 5’ capping activities of the newly synthesized RNA, respectively. Given the crucial role of this enzyme for viral replication, NS5 constitutes an attractive antiviral target to inhibit viral replication. In this study, we determined the structure of the ZIKV NS5 protein using X-Ray crystallography combined with several structural biology approaches to characterize the supramolecular arrangement of the ZIKV NS5 protein. We identified the monomer-monomer and dimer-diner interactions to form fibril-like structures, and evaluated the role of oligomer formation, using in-vitro polymerization assays. We also evaluated the in-vivo effect of NS5-oligomerisation in chicken embryos, stablishing a connection between this protein and microcephaly. One of the most important RNA structures present at the 5’UTR of flavivirus genomes is the 5SLA. This structure was identified previously to bind the NS5 protein, acting as a promoter and being essential for viral replication. We assayed and optimized the NS5-5SLA complex stability using biophysical and biochemical techniques and determined the structure of the complex by single particle cryo-EM. Comparisons between the NS5-5SLA complex and the NS5 crystallographic structure revealed for the first time in flavivirus, important conformational changes in the NS5 RdRP. We identified the residues involved in complex formation and characterized the effect of this binding on NS5 polymerization, shedding new light on the understanding of replication mechanisms in flaviviruses.El virus Zika (ZIKV) pertenece a la familia Flaviviridae y constituye una amenaza para la salud pública, especialmente debido a las malformaciones provocadas en neonatos. Los flavivirus presentan un genoma RNA de simple cadena con polaridad positiva, flanqueado por regiones no traducidas (UTR) que presentan una elevada estructura secundaria, seguido de una región codificante para una única poliproteína que por proteólisis dará lugar a tres proteínas estructurales (C, prM, E) y cinco proteinas no estructurales (NS1-5). En el extremo C-terminal se encuentra la proteina NS5 que presenta actividad ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP) y un dominio metil-transferasa (MTase) para copiar el genoma y añadir una caperuza al extremo 5’ del nuevo ARN sintetizado, respectivamente. Dado el papel crucial de este enzima en la replicación viral, la proteina NS5 constituye una diana antiviral muy atractiva para inhibir la replicación del virus. En este estudio, determinamos la estructura de la proteína NS5 de ZIKV, usando cristalografía de Rayos-X combinada con diferentes técnicas biofísicas para caracterizar la organización supramolecular de la proteína. Identificamos las interacciones monomero-monomero y dimero-dimero para caracterizar las estructuras fibrilares de la proteína y evaluamos los efectos de la dimerización en la actividad polimerasa in-vitro. También evaluamos los efectos de la oligomerización de NS5 in-vivo en embriones de pollo, estableciendo una conexión entre esta proteína y la aparición de microcefalia en fetos infectados. Una de las estructuras de ARN más importantes presentes en el 5’UTR del genoma de los flavivirus es el 5SLA. Previamente se describió que esta estructura se unía a NS5 y actuaba como un promotor, siendo ademas esencial para la replicación viral. Medimos y optimizamos la estabilidad del complejo NS5-5SLA mediante técnicas biofísicas y bioquímicas y determinamos la estructura del complejo mediante cryo-EM. Las comparaciones entre la estructura cristalográfica y cryo-EM de NS5 revelaron, por primera vez en flavivirus, cambios conformacionales importantes en el dominio RdRP. Identificamos los residuos implicados en la formación del complejo y caracterizamos el efecto de la unión de NS5 a 5SLA sobre su actividad polimerasa. Estos resultados arrojan nueva luz para entender los mecanismos de replicación en los flavivirus