Régulation de l’homéostasie cellulaire du Mn : rôles insoupçonnés de TMEM165, SERCA et SPCA1

La glycosylation est un processus cellulaire universel chez tous les organismes vivants visant aux transferts successifs de monosaccharides sur une molécule acceptrice, le plus souvent une protéine, un lipide ou un autre monosaccharide. Chez les eucaryotes, différentes voies de glycosylation coexistent, aboutissant à la biosynthèse d’une grande diversité de structures glycanniques aux fonctions diverses. Chez l’homme, des perturbations au cours d’une ou plusieurs réactions de glycosylation sont à l’origine de glycopathologies génétiques rares appelées Congenital Disorders of Glycosylation (CDG). L’une d’entre elles, TMEM165-CDG, a été identifiée en 2012 par notre équipe et est au cœur de ces travaux. Des mutations pathogéniques dans le gène TMEM165 sont en effet responsables de l’apparition de sévères défauts de glycosylation caractérisés par la présence de structures N-glycanniques principalement sous-galactosylées. Lors de la caractérisation de ces anomalies de glycosylation, les travaux de l’équipe ont rapidement établi un lien entre déficience en TMEM165 et dérégulation de l’homéostasie du manganèse (Mn2+) de l’appareil de Golgi. Dès lors, et au regard de précédents résultats de l’équipe, une fonction d’antiport Ca2+/Mn2+ fut assignée à TMEM165, permettant l’import d’ions Mn2+ dans l’appareil de Golgi afin d’assurer un environnement ionique adéquat et nécessaire au bon déroulement des réactions de glycosylation. De façon extrêmement intéressante, il s’avère qu’un apport exogène de Mn2+ dans le milieu de culture de cellules déficientes en TMEM165 corrige complètement les défauts de N-glycosylation observés dans ces cellules. Par ailleurs, TMEM165, tout comme Gdt1p son orthologue chez la levure Saccharomyces cerevisiae, est une protéine extrêmement sensible aux ions Mn2+ étant rapidement dégradée via la voie lysosomale en présence de fortes concentrations de Mn2+. Un lien étroit s’établit donc entre fonctions de TMEM165/Gdt1p, homéostasie du Mn2+ de l’appareil de Golgi et glycosylation golgienne ; trois aspects qui furent au centre de mes travaux. Plus particulièrement, ma thèse porte sur (i) la compréhension des mécanismes de correction des défauts de glycosylation observés dans les cellules déficientes en TMEM165 et induits par le Mn2+ et (ii) les liens potentiels entre différents acteurs essentiels au maintien de l’homéostasie ionique de la voie de sécrétion que sont les pompes calciques (Ca2+) réticulaires SERCA2, TMEM165 et SPCA1, seule pompe ATPasique de l’appareil de Golgi connue à ce jour pour importer à la fois des ions Ca2+ et Mn2+. A travers l’utilisation de lignées cellulaires humaines génétiquement invalidées pour TMEM165 ou ATP2C1 et de levures déficientes en Gdt1p et/ou Pmr1p, notre étude a conduit à l’élaboration de différents concepts reliant intimement ces protéines. D’une part, nous avons démontré que l’activité des pompes SERCA était cruciale au maintien des réactions de glycosylation golgiennes en absence de TMEM165 par leur contribution dans le pompage et la redistribution des ions Mn2+ depuis le cytosol vers l’appareil de Golgi. D’autre part, TMEM165 est indispensable au maintien des réactions de glycosylation golgiennes en absence de SPCA1 et lorsque SERCA2 est inhibée par des agents pharmacologiques. Parallèlement, nos travaux ont mis en évidence que l’expression et la stabilité des protéines TMEM165, chez l’homme et Gdt1p, chez la levure étaient directement liées aux capacités de SPCA1 et Pmr1p à importer des ions Mn2+ dans l’appareil de Golgi. Bien que des différences s’observent entre l’homme et la levure Saccharomyces cerevisiae, l’ensemble de mes travaux illustre l’importance de l’homéostasie ionique de l’appareil de Golgi dans le maintien du processus de glycosylation golgien.Glycosylation is a universal cellular process in all living organisms where monosaccharides are added one by one onto an acceptor molecule, most of the time a protein, a lipid or another monosaccharide. In eukaryotes, many glycosylation pathways occur simultaneously, resulting in the biosynthesis of a broad variety of glycan structures with different functions. In humans, if one -or more- glycosylation reactions are genetically impaired, Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) appear. One of them, TMEM165-CDG, was identified in 2012 by our group and is at the heart of this work. Pathogenic mutations in TMEM165 gene cause severe glycosylation defects mainly characterized by hypo-galactosylated N-glycan structures. While characterizing these glycosylation abnormalities, a link has rapidly been established by the team between TMEM165 deficiency and Golgi manganese (Mn2+) homeostasis disruption. Therefore, and based on previous work, TMEM165 was assumed to act as a Ca2+/Mn2+ antiporter, allowing the import of Mn2+ into the Golgi lumen in order to sustain an adequate ionic environment, required for all glycosylation reactions. Interestingly, we also found that exogenous addition of Mn2+ in the culture medium of TMEM165 deficient cells completely rescues the N-glycosylation defects observed in these cells. Moreover, TMEM165, like Gdt1p its yeast ortholog, is a protein highly sensitive to Mn2+, being rapidly degraded via the lysosomal pathway in the presence of high Mn2+ concentrations. All in all, a close link exists between TMEM165/Gdt1p, Golgi Mn2+ homeostasis and Golgi glycosylation; the three major aspects focused in my PhD research. More precisely, my thesis focuses on (i) understanding the mechanisms of Mn2+-induced glycosylation rescue in TMEM165 deficient cells and (ii) the potential links between different key players acting in the regulation of the secretory pathway ionic homeostasis which are the Sarco/Endoplasmic Reticulum calcium (Ca2+)-ATPase SERCA2, TMEM165 and SPCA1 (Secretory Pathway Ca2+/Mn2+-ATPase), the only pump of the Golgi apparatus known to import both Ca2+ and Mn2+ in the Golgi lumen. Through the use of isogenic human cell lines knockout for either TMEM165 or ATP2C1 and yeasts lacking Gdt1p and/or Pmr1p, we highlighted three main concepts that closely link these proteins: TMEM165 (Gdt1p), SPCA1 (Pmr1p) and SERCA2. On the one hand, we demonstrated that the activity of SERCA pumps is crucial to sustain Golgi glycosylation reactions in absence of TMEM165 by their contribution in Mn2+ pumping and redistribution into the Golgi lumen. On the other hand, TMEM165 was found essential for maintaining Golgi glycosylation reactions in absence of both SPCA1 and when SERCA2 are inhibited by pharmacological agents. Moreover, we also shed light on the fact that expression and stability of TMEM165 (in humans) and Gdt1p (in yeast) were directly linked to the capacities of SPCA1 and Pmr1p to import Mn2+ into the Golgi lumen. Although differences exist between humans and yeast Saccharomyces cerevisiae, all of our work illustrates the crucial importance of the ionic homeostasis of the Golgi apparatus to sustain Golgi glycosylation reactions