Genetic and molecular analysis of the Nod factor-independent signaling mechanisms in the tropical legume Aeschynomene evenia

Plusieurs espèces appartenant au genre tropical Aeschynomene développent une symbiose fixatrice d’azote originale avec des Bradyrhizobium photosynthétiques, qui ne passe pas par la reconnaissance des facteurs Nod rhizobiens et la formation de cordons d’infection. Pour mettre à jour les mécanismes moléculaires de cette symbiose dite Nod-indépendante, une approche de génétique directe est mise en œuvre chez Aeschynomene evenia. Elle combine le crible d’une population de mutagenèse EMS, ayant permis d’isoler 250 mutants de nodulation, au séquençage du génome d’A. evenia pour faciliter l’identification de gènes symbiotiques à partir de ces mutants. Au cours de ma thèse, j’ai mis à profit le génome nouvellement disponible d’A. evenia en menant une analyse comparative de gènes symbiotiques afin d’obtenir une vue d’ensemble des mécanismes potentiellement conservés ou divergents entre A. evenia et les légumineuses modèles M. truncatula et L. japonicus. Ce travail a mis en exergue des différences génétiques importantes, notamment au niveau des étapes de reconnaissance des rhizobiums et d’infection. Ensuite, pour déterminer quels gènes connus chez les légumineuses modèles sont aussi impliqués dans la symbiose Nod-indépendante, j’ai recherché des mutations par Targeted Sequence Capture de ces gènes sur les 250 mutants de nodulation d’A. evenia. Cette approche a révélé que nombreux mutants Nod-, qui sont bloqués dans les étapes les plus précoces de l’interaction, sont altérés dans plusieurs gènes de la voie de signalisation symbiotique activée par les rhizobiums : AePOLLUX, AeCCaMK, AeCYCLOPS, AeNIN et AeNSP2. En revanche, aucune mutation n’a été trouvée dans les gènes codant des récepteurs symbiotiques.Pour identifier chez A. evenia de nouveaux gènes clé de la symbiose Nod-indépendante, j’ai appliqué une approche sans a priori, le Mapping-by-Sequencing, sur les mutants Nod- n’ayant pas de gène connu associé. Cette stratégie a été fructueuse pour identifier deux gènes : AeRLCK, qui code un Receptor-Like Cytoplasmic Kinase (RLCK), et AeCRK, codant une Cysteine-rich Receptor-like Kinase (CRK). Il est notable que ces deux gènes ne sont pas retrouvés chez les légumineuses modèles et qu’ils appartiennent à deux familles d’acteurs de signalisation précoce pouvant participer à la formation de complexe récepteurs avec des Receptor-Like Kinases (RLK) pour assurer la transduction d’un signal extracellulaire. Une caractérisation de ces deux nouveaux acteurs symbiotiques a révélé qu’AeRLCK est issu d’une duplication en tandem propre aux Aeschynomene Nod-indépendantes et qu’AeCRK est soumis à une sélection purifiante chez ces mêmes espèces, ce qui suggère qu’ils pourraient fonctionner spécifiquement dans la symbiose Nod-indépendante. Pour préciser leur rôle et les positionner par rapport à la voie de signalisation symbiotique conservée avec les légumineuses modèles, j’ai également initié une analyse comparative fine au niveau phénotypique et moléculaire. La découverte d’AeRLCK et AeCRK représente une avancée importante dans notre compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent l’établissement de la symbiose Nod-indépendante. Elle ouvre maintenant la voie à une analyse fonctionnelle de ces deux acteurs symbiotiques et à une recherche des récepteurs symbiotiques avec qui ils peuvent interagir.Many Aeschynomene sp. belonging to the Dalbergioids family, like Arachis hypogea, can develop a nitrogen-fixing root symbiosis with photosynthetic bradyrhizobia. Among them, certain strains are lacking the nod genes operon which is essential for Nod Factor biosynthesis. First genetic analysis in Aeschynomene evenia revealed that many genes involved in bacterial perception in model legumes are not functionals in the Nod-independent symbiosis whereas the genes involved in signal transduction are mainly conserved.In the aim to better understand how Nod-independent nodulation has been set up, we searched to identify new genes using forward genetics on A. evenia. An EMS mutagenized population has been generated leading to the isolation of 250 stable mutant lineages affected in the nodulation process. Among these mutants, half of them are totally unable to nodulate and are qualified by « Nod- ».A Targeted-Sequence-Capture analysis has been realized on the Nod- mutants and allows the identification of mutations in many known genes of the « Nod signaling pathway » This kind of analysis is possible thanks to a reference genome which has been sequenced and annotated recently. Mutations have been found in AePOLLUX, AeCCaMK, AeCYCLOPS, AeNIN, and AeNSP2 genes whereas no mutations have been found in any LysM-RLK (Nod factor receptors). Gene expression analysis by Q-PCR on different mutants have been realized to observe eventual deregulation of other symbiotic genes.Concerning Nod- mutants for which no known symbiotic gene has been associated, we performed a Mapping-by-Sequencing approach that is combining cartography and whole-genome sequencing to localize homozygous mutations. For some mutants with the same phenotype, we identify mutations on a gene coding a Receptor-Like Cytoplasmic Kinase (RLCK). This gene underwent a specific duplication event that is only observed in Nod-independent Aeschynomene species, suggesting a role of this cytoplasmic kinase during the Nod-independent symbiosis. This kind of protein devoid of the extracellular domain and belonging to a family known for associates with Receptor-Like Kinase (RLK) to transduce the signal and activation of genetic programs of development, reproduction, growth, and immunity. However, this is one of the first times that a protein of this family is shown to be involved in nitrogen-fixing symbiosis (except for LjNiCK4 in 2019).Furthermore, the Mapping-by-sequencing approach allows the identification of 3 other new symbiotic genes (AeCRK, AeRINRK, AeMLRR-RLP) that are not described in model legumes (except LjRINRK1 in 2019). In this manuscript, the results of these analyses will be presented and discussed in order to understand the molecular mechanisms governing the nodulation in the absence of Nod factors