Blastocystis spp. from epidemiology to pathophysiology. What is the link with irritable bowel syndrome?

Le protozoaire anaérobie Blastocystis spp. est le parasite le plus fréquemment identifié dans les selles humaines, quelle que soit la région du monde considérée, même si peu de données sont disponibles en France. Par ailleurs, ces chiffres varient grandement selon les techniques de diagnostic utilisées. Son caractère pathogène est controversé car, dans la majorité des cas, Blastocystis spp. est isolé chez des patients asymptomatiques. Néanmoins, (i) l’analyse des données génomiques de Blastocystis sp. montre que le parasite code pour un nombre important de protéases sécrétées, facteurs de virulence connus chez d’autres parasites ; (ii) plusieurs études de prévalence suggèrent une association avec le Syndrome de l’Intestin Irritable (SII), une colopathie chronique fonctionnelle caractérisée notamment par une dysbiose et une augmentation de la perméabilité paracellulaire. Au cours de nos travaux, nous avons complété les données épidémiologiques du parasite au travers d’une étude multicentrique en France et au Liban, en utilisant une technique de détection par biologie moléculaire. Ainsi, en France, la prévalence globale atteint 18,1% avec des chiffres significativement plus élevés en été, le sous-type 3 (ST3) est majoritaire (43,3% des cas). La notion de voyage dans l’année précédente apparaît comme un facteur de risque de contamination. La prévalence libanaise est de 63%, avec également une prédominance du ST3 (46,3%). Nous nous sommes ensuite intéressés au lien potentiel entre Blastocystis spp. et le SII. Nous avons montré que le risque d’être infecté par Blastocystis spp. était deux fois élevé chez les sujets atteints de SII comparativement à des sujets non-SII. Nous avons observé une dysbiose chez les individus porteurs de Blastocystis sp., qu’ils soient atteints de SII ou non, avec une diminution significative de bactéries considérées comme « bénéfiques », les bifidobactéries et Faecalibacterium prausnitzii, bactérie aux propriétés anti-inflammatoires. Compte tenu de ces modifications du microbiote intestinal et du manque de recul, Blastocystis spp. fait partie des microorganismes à rechercher chez un donneur avant transplantation de microbiote fécal. Dans cette optique, nous avons comparé 3 techniques de diagnotic par PCR en temps réel décrites dans la littérature ainsi que la trousse SeegeneTM (Eurobio), sur une cohorte de 140 individus et montré des différences de performances entre ces outils. Afin de mieux comprendre les impacts du parasite sur l’équilibre intestinal, nous avons développé des approches in vitro et in vivo. Nous avons mis en évidence in vitro une augmentation de la perméabilité para-cellulaire sous l’effet de 2 protéases à cystéine parasitaires sécrétées, fonctionnant en tandem, une légumaïne et une cathepsine B. Nous avons ensuite mis au point un modèle animal d’infection chronique par Blastocsytis sp. chez le rat. Nous avons procédé par gavage oral de kystes purifiés issus de selles humaines. Des immunomarquages réalisés sur des colons de rats infectés ont montré que Blastocystis sp. est capable de pénétrer dans la couche de mucus. Nous avons également pu observer par microscopie électronique que le parasite pouvait adhérer aux cellules épithéliales. Afin de standardiser ce modèle animal, nous avons travaillé sur la forme kystique du parasite, qui est la forme infectieuse. Nous avons caractérisé les kystes en mettant en évidence la présence de 1 à 4 noyaux et une paroi riche en chitine et D-mannose. Ces caractéristiques nous permettront de valider les formes obtenues par enkystement in vitro à partir de parasites en culture axénique. Nos résultats suggèrent donc un impact possible de Blastocystis spp. en santé humaine (patients colopathes, receveurs de transplantation de microbiote fécal, simple sujet porteur) et ouvrent de nouvelles pistes pour l’exploration de sa pathogénie et de son lien avec le SII.The anaerobic protozoan Blastocystis spp. is the most frequently identified parasite in human feces in all regions of the world, although few data are available in France. Moreover, these figures vary greatly according to the diagnostic techniques used. Its pathogenicity is controversial because, in the majority of cases, Blastocystis spp. is isolated from asymptomatic patients. Nevertheless, (i) analysis of genomic data of Blastocystis sp. shows that the parasite encodes a significant number of secreted proteases, known virulence factors in other parasites; (ii) several prevalence studies suggest an association with Irritable Bowel Syndrome (IBS), a chronic functional colopathy characterized by dysbiosis and increased paracellular permeability. In the course of our work, we completed the epidemiological data of the parasite through a multicenter study in France and Lebanon, using a molecular biology detection technique. Thus, in France, the overall prevalence reached 18.1% with significantly higher figures in summer, subtype 3 (ST3) is the majority (43.3% of cases). The notion of having travelled in the previous year appears to be a risk factor for contamination. The Lebanese prevalence is 63%, with ST3 also predominating (46.3%). We then looked at the potential link between Blastocystis spp. and IBS. We showed that the risk of being infected by Blastocystis spp. was twice as high in IBS subjects compared to non-IBS subjects. We observed a dysbiosis in individuals carrying Blastocystis sp., whether they had IBS or not, with a significant decrease in bacteria considered "beneficial", bifidobacteria and Faecalibacterium prausnitzii, a bacterium with anti-inflammatory properties. Given these changes in the intestinal microbiota and the lack of experience, Blastocystis spp. are among the microorganisms to look for in a donor before fecal microbiota transplantation. With this in mind, we compared 3 real-time PCR diagnostic techniques described in the literature and the SeegeneTM kit (Eurobio), on a cohort of 140 individuals and showed differences in performance between these tools. In order to better understand the impacts of the parasite on the intestinal balance, we developed in vitro and in vivo approaches. We have demonstrated in vitro an increase in paracellular permeability under the effect of two secreted parasite cysteine proteases, a legumain and a cathepsin B, working in tandem. We then developed an animal model of chronic infection by Blastocsytis sp. in rats. We proceeded by oral gavage of purified cysts from human feces. Immunolabeling of infected rat colons showed that Blastocystis sp. is able to penetrate the mucus layer. We were also able to observe by electron microscopy that the parasite could adhere to epithelial cells. In order to standardize this animal model, we worked on the cystic form of the parasite, which is the infectious form. We characterized the cysts by showing the presence of 1 to 4 nuclei and a wall rich in chitin and D-mannose. These characteristics will allow us to validate the forms obtained by encystation in vitro from parasites in axenic culture. Our results suggest a possible impact of Blastocystis spp. in human health (colopathic patients, fecal microbiota transplantation recipients, simple carrier subjects) and open new avenues for the exploration of its pathogenesis and its link with IBS