From intra tumoral heterogeneity to research of extracellular vesicles within liquid biopsy for personalized medicine

Les gliomes représentent 80% des tumeurs cérébrales malignes primitives et sont classés selon différents grades de malignité. Les glioblastomes, groupe le plus agressif, représentent plus de la moitié de tous les gliomes. Il s'agit de tumeurs dont la composition est hétérogène, présentant notamment de zones de nécrose, de prolifération vasculaire, de prolifération cellulaire. La survie des patients peut aller de quelques mois à quelques années après la chirurgie et la chimiothérapie. L’imagerie par spectrométrie de masse MALDI est une technique intéressante pour l’étude de ces tumeurs, car elle permet de prendre en considération l'hétérogénéité intra-tumorale. Dans cette étude, l’imagerie MALDI MS est couplée à la microprotéomique localisée sur tissu dans l'objectif d'identifier des sous-groupes de glioblastomes afin d'aider au diagnostic et au pronostic. Les images moléculaires ont été générées à partir de coupes fines de tissus dans le but de déterminer la localisation de peptides digérés. Ensuite, des analyses statistiques non supervisées nous ont permis de générer un regroupement hiérarchique de régions moléculaires homogènes au sein du tissu. Une analyse restreinte à ces différentes régions à nous a donné accès à leur contenu protéique. Le regroupement hiérarchique a révélé trois régions moléculaires dans l’ensemble des échantillons. À partir de ces régions, 3 groupes de patients ont été identifiés : le groupe A (13/50 patients), le groupe B (9/50 patients) et le groupe C (23/50 patients) . Cinq patients sont restés non classables. Chaque groupe présentait des signatures moléculaires spécifiques. Les analyses microprotéomiques ont montré un panel de protéines spécifiquement surexprimées dans chaque groupe : les protéines surexprimées dans le groupe A sont associées à la neurogenèse ; celles du groupe B sont associées à une activation du système immunitaire et celles du groupe C sont impliquées dans des processus viraux. Enfin, nous avons identifié 6 nouveaux marqueurs pronostiques des glioblastomes qui pourraient aider à stratifier les patients et aider à la décision thérapeutique.En parallèle, nous nous sommes intéressés au développement d’une nouvelle technique de microprotéomique localisée basée sur l’expansion de tissu. Agrandir le tissu permet, tout en conservant les méthodes de protéomique conventionnelle, d’analyser des régions plus petites que celles atteignables actuellement. Jusqu’à 655 protéines ont pu être identifiées dans une région de 460 µm de diamètre, ce qui correspond à une moyenne de 940 cellules. De plus, cette stratégie est intéressante pour l'imagerie MS, car elle donne la possibilité de cartographier facilement un grand nombre de protéines sur la base de leur quantification avec une résolution spatiale inférieure à 350 µm. En ce sens, l’expansion de tissu est d’un grand intérêt pour augmenter la résolution spatiale de la protéomique localisée.Finalement, étudier les vésicules extracellulaires circulant dans le sang pourrait à terme permettre d'aider au dépistage, au diagnostic ainsi qu'au suivi des glioblastomes. L’analyse protéomique des vésicules du sang des patients pourrait permettre d’identifier des protéines ou des réseaux déjà identifiés dans les échantillons tumoraux. Les résultats préliminaires à partir de plasma témoin montrent qu’il est possible d’isoler des vésicules et de réaliser des analyses protéomiques. Ainsi, il serait intéressant de pouvoir associer un profil de vésicule extracellulaire pour chaque groupe de tumeurs. De plus, nous avons été capables d’isoler spécifiquement les vésicules contenues dans une coupe fine de cerveau de rat. Ces résultats sont encourageants et à terme il sera possible d’identifier les vésicules provenant de la tumeur.Gliomas account for 80% of all malignant brain tumors and are classified within different maligniy grades. Glioblastomas, the most aggressive group, represent more than half of all gliomas but remain a heterogeneous group. Indeed, patient survival ranges from several months to a few years after surgery and chemotherapy. To study gliomas, MALDI mass spectrometry imaging is a technique of choice, allowing for tumor heterogeneity analysis. In this study, MALDI-MSI is coupled with spatially-resolved microproteomic aiming at identifying subgroups of glioblastomas patients in order to help for diagnosis and prognosis. Molecular images are generated from thin tissue sections to determine digested peptides spatial localizations. Based on unsupervised statistical analysis, we generated hierarchical clustering of homogeneous molecular regions. According to these regions, spatially resolved proteomic provided a broad range of protein identification and their relative quantifications. The hierarchical clustering reveals three molecular regions within all the tumor samples. Based on these regions, three groups of patients can be determined: group A (13/50 patients), group B (9/50 patients) and group C (23/50 patients) and 5 non-classifiable patients, each group with specific molecular signatures. Microproteomic analyzes show a panel of proteins specifically overexpressed in each group: proteins overexpressed in group A are associated with neurogenesis; those of group B are linked to immune system activation; and those of group C are involved in viral processes. Finally, we have identified 6 new prognosis markers for glioblastomas that could help stratifying patients and orient clinician in choosing therapeutics.In parallel, we were interested in developing a novel spatially resolved microproteomic technique based on tissue expansion. Tissue enlargement allows, while maintaining conventional proteomics methods, to analyze regions smaller than those currently achievable. Up to 655 proteins were identified within a region of 460 µm diameter, which corresponds to an average of 940 cells. In addition, this strategy is relevant for MS imaging as it gives the possibility to easily map a large number of proteins based on their quantification within a spatial resolution of less than 350 μm. Thus, tissue expansion is of great interest in increasing the spatial resolution of localized proteomics.Finally, studying circulating extracellular vesicles in blood may ultimately lead to an earlier diagnosis of glioblastomas. Proteomic analysis of patients' blood vesicles can identify proteins or networks already identified in tumor mass. Preliminary results from control plasma show that it is possible to isolate and perform proteomic analyzes on circulating vesicles. Thus, it would be interesting to be able to associate an extracellular vesicle profile for each group of tumors. In addition, we have been able to specifically isolate the vesicles embedded in a thin section of rat brain. These results are encouraging and, in the long term, will make it possible to identify vesicles originating from the tumor