Structural studies of multispecific antibody-antigen complexes by cryo-electron microscopy

La microscopie cryoélectronique (cryo-EM) a connu une montée en puissance et en popularité ces dernières années. En effet, les progrès du matériel et des logiciels ont permis la détermination de structures à des résolutions élevées (<4 Å). Cela a permis l'exploration de la cryo-EM comme outil pour élucider les interactions anticorps-antigène dans des conditions quasi-natives, une avancée importante pour la recherche pharmaceutique. Dans le domaine des anticorps thérapeutiques, les anticorps multispécifiques, qui sont conçus pour se lier à deux ou plusieurs cibles, sont actuellement du plus grand intérêt. Malheureusement, il n'y a actuellement aucune publication d’étude cryo-EM à haute résolution d'anticorps entiers, ou d'interfaces anticorps-antigène dans le contexte de l'anticorps complet. Ainsi, les principaux objectifs de cette thèse étaient doubles : 1) La mise en place d'un protocole, de la préparation des échantillons à la structure, pour les études cryo-EM d'anticorps entiers, qui servira de point de départ à de futurs projets dans ce domaine ; 2) L'utilisation de la cryo-EM pour élucider à haute résolution les détails des interfaces antigène-anticorps multispécifiques dans le contexte de l'anticorps complet. Ces travaux ont ciblé trois anticorps : CODV (bispécifique), TBTI (bispécifique) et TDT (trispécifique), avec un fort accent sur le CODV et ses complexes avec les petits antigénes IL4 et IL13.Les premiers travaux (chapitre 1) se sont concentrés sur la préparation, la purification et la caractérisation biophysique d'anticorps individuels et de complexes CODV-antigène. Ici, les études SPR ont montré que CODV se lie à ses deux antigènes IL4 et IL13 avec une affinité picomolaire et que cette affinité est indépendante de l'ordre de liaison ou des effets de position.Des expériences préliminaires de microscopie électronique à coloration négative (NSEM) (chapitre 2) ont fourni des informations sur la qualité et la dispersion des échantillons et ont permis la détermination de reconstructions à basse résolution. Les expériences NSEM ont suggéré un niveau élevé de flexibilité et d'hétérogénéité conformationnelle des anticorps, en particulier au niveau du Fc. De plus, les reconstructions obtenues pour les complexes CODV-antigène n'ont montré aucune densité correspondant aux antigènes.En raison des avantages thérapeutiques du format et de sa priorité pour Sanofi, le système CODV a ensuite été utilisé pour la mise en place d’un protocole de cryo-EM (chapitre 3). Des stratégies de préparation de grille ont d'abord été explorées afin de limiter l'agrégation des anticorps CODV et leur aversion pour les supports conventionnels. Des jeux de données Cryo-EM pour apo-CODV, CODV-IL4 et CODV-IL4 / IL13 ont ensuite été collectés au microscope Titan Krios 300 keV de la ligne de lumière ESRF CM01. Le traitement de ces données a confirmé à la fois l'absence apparente d'antigènes liés à CODV et la forte hétérogénéité conformationnelle de l'anticorps déjà observée dans les expériences NSEM. Ceci signifie que seules des reconstructions à très faible résolution, parfois incomplètes, pouvaient être obtenues.Une stratégie de réduction de la flexibilité conformationnelle a donc été proposée. Cela comprenait le marquage de l'antigène IL13 avec du tralokinumab, un anticorps anti-IL13 (chapitre 3). Un complexe ternaire CODV-IL13-Tralokinumab a donc été préparé et purifié. Les expériences NSEM ont révélé la présence de densité pour IL13 et des expériences de cryo-EM basées sur le protocole développé ont été réalisées. Celles-ci ont abouti à une reconstruction à résolution moyenne (3.93 Å) de l'interface CODV-IL13-Tralokinumab, suggérant que cette stratégie de marquage peut être utilisée dans d'autres études. Ce travail ouvre donc la voie à de futures études cryo-EM des complexes anticorps-antigène, en particulier pour celles où la présence de Fc est essentielle pour le bon contexte biologique, comme l'opsonisation ou la dégranulation cellulaire.Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has experienced a surge in capability and popularity in recent years. In particular, advances in hardware and software have allowed the imaging of the structures at progressively higher resolutions (