Novel insights on complex glycosylation regulation by O-GlcNAcylation in healthy and cancer colon cell lines

Le cancer colorectal (CCR) est une pathologie dont les causes tiennent en partie d’un style de vie basé sur un régime alimentaire de type occidental et un mode de vie sédentaire. Cela implique par conséquent que le CCR soit associé à d’autres troubles métaboliques tels que l’obésité et le diabète. D’un consensus général on considère que le CCR est une maladie qui est mieux traitée si elle est dépistée relativement tôt ; malheureusement il n’existe toujours pas d’outils de diagnostic suffisamment fiables. A ce propos, différents types de glycosylation ont été proposés comme de potentiels biomarqueurs de cette maladie. Les travaux abordés dans cette thèse ont concerné l'influence de la O-GlcNAcylation (consistant en le transfert d'un seul monosaccharide de N-acétylglucosamine sur des résidus de sérine/thréonine de protéines cytoplasmiques, nucléaires et mitochondriales), sur la glycosylation complexe dans des lignées cellulaires coliques (HT29, HCT116 et CCD841CoN). La O-GlcNAcylation est intimement liée au statut nutritionnel, il est d’ailleurs proposé que son niveau soit plus élevé dans les pathologies métaboliques. Néanmoins il est clairement montré que les cellules et les tumeurs coliques expriment des niveaux plus élevés de O-GlcNAcylation. Plusieurs études ont montré que l’inhibition ou la délétion de la O-GlcNAc transférase (OGT), l’enzyme responsable des processus de O-GlcNAcylation, réduisait l'agressivité ou les propriétés associées au caractère tumoral dans différents modèles de cancer. Quelques études ont également montré que la sous-régulation de l’OGT se répercutait sur les glycosylations complexes : N- et O-glycanes, et glycosphingolipides (GSLs). La O-GlcNAcylation participe à des processus cellulaires clés tels que la transcription et la traduction. Dans une étude préliminaire, nous avons examiné les niveaux de transcrits de quatre-vingt-six glycosyltransférases et glycosidases dans des conditions de siOGT. Le siOGT a permis de constater que plusieurs de ces gènes étaient régulés positivement ou négativement, bien que parmi ces gènes seuls 10 étaient régulés négativement de manière significative. L'influence de l’OGT sur l’expression protéique de plusieurs glycosyltransférases a également été explorée. Nous avons ensuite utilisé plusieurs lectines en microscopie par fluorescence et en cytométrie en flux ainsi que la spectrométrie de masse (glycomique) afin d'élucider les structures complexes des glycanes et leur niveau d’expression dans les cellules coliques traitées par des siOGT. La diminution de O-GlcNAcylation n'a eu qu’un effet modéré sur les N- et O-glycanes globaux. Cependant, l'expression de plusieurs antigènes de surface a été modifiée par le siOGT. La E-cadhérine, un facteur majeur de la transition épithéliale-mésenchymateuse, a été régulée positivement dans les cellules HT29 traitées par le siOGT. De plus, les glycanes complexes portés par la E-cadhérine ont été eux-mêmes modifiés dans les cellules traitées par le siOGT. L'analyse MALDI des GSLs extraits de cellules HCT116 a révélé une altération significative de ces derniers dans les cellules siOGT, inversant le patron d’expression des GSLs décrits dans certaines cellules cancéreuses. Les GSLs des séries Globo, Gb3 et Gb4 ont été régulés à la hausse, tandis que les GSL gangliosidiques GM1a, GM2 et GD1a ont été régulés à la baisse. Cette étude démontre pour la toute première fois une relation entre la O-GlcNAcylation et les GSLs. Étant donné que les GSLs jouent un rôle important dans la reconnaissance cellulaire, la transduction du signal et d'autres propriétés de la surface cellulaire, ces observations pourraient expliquer en partir les changements phénotypiques liés au siOGT. De manière générale, une diminution de l’α2,3-sialylation est observée dans des conditions siOGT. Ces travaux sont les premiers à montrer un effet de la déplétion en OGT sur l’ensemble du glycome complexe, en particulier ceux s’exprimant à la surface des cellules.Colorectal cancer (CRC) remains a major cause of health burden in Europe and in the western world. It is a disease of lifestyle with the western diet and a sedentary lifestyle widely implicated. This implicates CRC to be associated with other metabolic disorders like obesity and diabetes. The general consensus is that it is a disease that is hugely avoidable and treatable if detected early however reliable detection tools are still lacking. Glycosylation biomarkers have been proposed as potentially a new frontier against this disease. The work covered in this thesis pertains to the influence of O-GlcNAcylation (the transfer of a single N-acetyl glucosamine monosaccharide on serine/ threonine residues), on complex glycosylations in colon cells (HT29, HCT116 and CCD841CoN). O-GlcNAcylation is a nutrient sensor which conveys the metabolic state and indeed is aberrantly regulated in metabolic disease. CRC cells and tissues express higher levels of O-GlcNAcylation and an accompanying phenotype of high proliferation and aggressive tumours. There are numerous studies showing that silencing O-linked N-acetylglucosamine transferase (OGT), the enzyme that catalyses O-GlcNAcylation, decreases the aggressiveness or cancer-like properties in several cancer models. There is little evidence starting to accumulate that shows that in these siOGT cells or tissue there is also a change in other complex glycosylations (N-, O- or glycosphingolipids glycans). O-GlcNAcylation is known to participate in key cell processes like transcription and translation. In this preliminary work, we look at the transcriptomic expression of eighty-six glycosyl transferases and glycosidases gene transcripts when OGT is silenced. Silencing OGT resulted in several of these genes being upregulated or downregulated but only 10 genes were significantly downregulated. The translational influence of OGT on several glycosyl transferases was also explored. We used several techniques namely; fluorescent lectin microscopy, lectin aided FACS analysis and several mass spectrometry techniques (glycomics), to study the complex glycan structures and expression in siOGT colon cells. Silencing O-GlcNAcylation has little effect on the global N- and O-glycans as elucidated by glycomic profiling. However, cell surface expression of several glyco-antigens was altered in siOGT. E-cadherin, a major influencer of the epithelial-to-mesenchymal transition, is upregulated in siOGT transfected HT29 cells. Furthermore, the complex glycans it carries are altered in the process. This could in part explain some of the siOGT phenotypes noted in other studies. Using MALDI mass spectrometry analysis, in HCT116 cells we found that glycosphinogolipid (GSL) expression is altered significantly in siOGT HCT116 cells. There is a reversal of some known cancerous GSL patterns; Globo series, Gb3 and Gb4 GSLs were upregulated, while ganglioside GSLs GM1a, GM2 and GD1a are downregulated. This is the first time an association has been made between O-GlcNAcylation and GSLs. As GSLs play an important part in cell recognition, signal transduction and other cell surface properties this may be one of the key links with the siOGT phenotype. All together there is a decrease in several α2,3-sialylated glycans when OGT is silenced. For the first time in scientific literature we show the global glycan effect of silencing OGT on the expression of complex glycans particularly at the cell surface, adding several new findings