In vivo study of the role of energetic and mitochondrial metabolism in the therapeutic resistance of acute myeloid leukemia

Le traitement des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) reste un défi clinique majeur en raison d'un mauvais pronostic et d'un taux de rechute élevé. Nous avons précédemment montré que la résistance à la cytarabine (AraC) est due à un métabolisme oxydatif mitochondrial (OxPHOS) stimulé, avec une augmentation de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) mitochondriales, des métabolites du cycle de Krebs, de l'oxydation des acides gras (FAO) et de la production d'ATP mitochondrial. Dans ce contexte, l'objectif de mon projet doctoral a été de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cet état OxPHOS élevé et de proposer une thérapie ciblant les cellules LAM résistantes à l'AraC. En premier lieu, nous avons découvert que les mitochondries adaptent de manière très fine le flux lipophagique pour l'ajuster à leurs besoins énergétiques grâce au contrôle des sites de contacts entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MERCs, lieu de formation d'autophagosomes. Sur le plan mécanistique, les mitochondries augmentent les MERCs par le biais du complexe IP3R1-VDAC1-MFN2, ce qui conduit à une augmentation de la formation des autophagosomes et de la dégradation des gouttelettes lipidiques au niveau de ce microdomaine RE-mitochondrie. En conséquence, la concentration en calcium mitochondrial (mCa2+) et la FAO sont augmentées, stimulant l'activité des déshydrogénases mitochondriales dépendantes du Ca2+ et l'OxPHOS pour soutenir la prolifération des cellules de LAM in vitro et in vivo. Cette première étude améliore nos connaissances sur le dialogue et la dynamique des contacts RE-mitochondrie et montre l'importance de l'OxPHOS, de l'autophagie et de la signalisation calcique dans la biologie des LAM. Nous avons ensuite démontré que les cellules résistantes à l'AraC, caractérisées par un métabolisme OxPHOS élevé, présentent une teneur élevée en mCa2+ et une surexpression de BCL2. Ainsi, l'utilisation de l'inhibiteur de BCL2, venetoclax (VEN), améliore l'efficacité anti-leucémique de l'AraC in vitro et in vivo dans des modèles murins de xénogreffes de patients atteints de LAM (PDX). En utilisant des analyses de respirométrie, de cytométrie en flux et de métabolomique, nous avons montré que VEN abroge l'hyperactivation de l'OxPHOS observée lors du traitement à l'AraC, en diminuant la teneur en mCa2+, en métabolites du cycle de Krebs et en diminuant la capacité énergétique des cellules. De plus, le séquençage ARN en cellule unique à partir de cellules de LAM résiduelles dans la moelle osseuse des PDX suivant les mono et bi-thérapies a mis en évidence trois souspopulations cellulaires transcriptionnellement différentes qui apparaissent spécifiquement dans la maladie résiduelle après traitement VEN+AraC. Ces sous-populations sont caractérisées par un enrichissement en gènes de l'organisation mitochondriale, de la migration et de la différenciation, en grande partie régulés par les facteurs de transcription MITF, E2F4 et p53.[...]Treating acute myeloid leukemia (AML) still remains a major clinical challenge due to a poor prognosis and a high rate of relapse. We previously showed that cytarabine (AraC) resistance is driven by elevated mitochondrial oxidative metabolism (OxPHOS) with an increase in mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production, TCA cycle metabolites, fatty acid oxidation (FAO) and mitochondrial ATP production. Therefore, the objective of my thesis project was to better understand molecular mechanism underlying this high oxidative state and propose combination therapy targeting AraC-resistant AML cells. Firstly, we found that mitochondria finely adapted the lipophagic flux to their own demands via the control of mitochondria-ER contact sites (MERCs) tethering. Mechanistically, mitochondria increased MERCs tethering to support ATP demand through the complex IP3R1-VDAC1-MFN2, leading to an increase in autophagosome formation and lipid droplet degradation closely to the ER-mitochondria microdomains. Consequently, increased mitochondrial calcium content and FAO enhanced Ca2+-dependent mitochondrial enzymes and OxPHOS activities to support AML cell proliferation in vitro and in vivo. This first study provides molecular insights into ER-mitochondria crosstalk and expands our understanding of the physiological importance of OxPHOS, autophagy and Ca2+ signaling in AML. We next demonstrated that high mitochondrial Ca2+ (mCa2+) content and high mitochondrially bound BCL2 level is also associated with high OxPHOS state of AraC-resistant cells. Accordingly, the FDA-approved BCL2 inhibitor venetoclax (VEN) enhanced the efficacy of AraC in vitro and in vivo in AML patient-derived xenograft (PDX) models. Using oxygraphic, flow cytometric and metabolomic analyses, we showed that VEN abrogates the hyperactivation of OxPHOS observed upon AraC treatment, especially in decreasing mCa2+ content, TCA cycle metabolites and OxPHOS capacity. Furthermore, single cell RNA-sequencing of residual AML cells purified from PDX bone marrow after single and duplet therapies uncovered three transcriptionally different cell subpopulations that specifically emerge in VEN+AraC residual disease. These subpopulations were characterized by an increase in mitochondrial organization, migration and differentiation, largely driven by MITF, E2F4 and p53 regulons. Importantly, amongst the nine most upregulated genes common to these three cell clusters, three encoded proteins involved in electron transport chain complex I (ETCI). Accordingly, disrupting ETCI dependency of VEN+AraC-persisting AML cells with ETCI inhibitor significantly increased the time-to-relapse in vivo. This second study demonstrated that the duplet combination VEN+AraC is a promising therapeutic avenue to improve anti-AML response to AraC and revealed the OxPHOS dependency of combinatorial therapy VEN+AraC resistance, supporting new combinatory options in AML therapy. In summary, my PhD work highlights that autophagy, mitochondrial calcium homeostasis and BCL2 are key players of oxidative metabolism and induce a dependency of AML cells on OxPHOS that drives drug resistance