Study of the molecular mechanisms governing neuroendocrine secretion : role of the interaction between chromogranin A and phosphatidic acid in the formation and exocytosis of secretory granules

L’exocytose régulée des cellules neuroendocrines est un mécanisme biologique fondamental finement contrôlé, régissant la libération des hormones dans le milieu extracellulaire suite à la fusion des granules de sécrétion à cœur dense (GSCD) avec la membrane plasmique. Ces organites, générés par bourgeonnement de la membrane du réseau trans-golgien (TGN), contiennent des hormones et des neuropeptides ainsi que des glycoprotéines solubles, les granines, et sont donc des acteurs essentiels de l’homéostasie cellulaire. Parmi les granines, la chromogranine A (CgA) joue un rôle majeur dans la biogénèse des GSCD mais les mécanismes moléculaires sous-jacents ne sont pas clairement identifiés. Avant mon arrivée, mon équipe d’accueil démontra que l’expression de la CgA dans des cellules non-endocrines COS7 (dépourvues de GSCD et donc d’exocytose régulée) induit la formation de vésicules ayant les caractéristiques des GSCD et que la délétion des extrémités terminales de la CgA organisées en hélice réduit significativement la formation de ces vésicules. Les hélices conférant aux protéines la capacité d’interagir avec les membranes biologiques, nous nous sommes intéressés durant ma thèse à l’interaction entre la CgA et les phospholipides membranaires. Nous avons montré tout d’abord que la CgA interagit spécifiquement avec l’acide phosphatidique (PA), un lipide conique ayant un rôle clé dans la sécrétion régulée neuroendocrine. Ensuite, à l’aide de la spectrométrie de masse LC-MS/MS, nous avons (i) identifié les formes de PA prédominantes (PA (36 : 1) et (40 : 6)) et observé qu’elles sont communes dans les membranes golgiennes et granulaires, et (ii) démontré que la CgA interagit avec ces formes de PA incluses dans des modèles de membranes artificielles, entraînant la déformation/le remaniement de la membrane de ces modèles. Par ailleurs, une analyse in silico de la séquence de la CgA a révélé la présence d’un domaine de liaison au PA (PABD) au niveau de la région C-terminale. Nous avons alors observé que la délétion de cette région altère significativement la liaison de la CgA aux formes de PA préalablement identifiées, ainsi que la formation des GSCD au sein des cellules neuroendocrines. Enfin, l’inhibition génétique ou pharmacologique de la PLD, enzyme responsable de la synthèse du PA au sein de la voie de sécrétion régulée, entraîne une diminution significative du nombre de GSCD formés. Ces travaux montrent pour la première fois l’importance de l’interaction CgA/PA dans la courbure de la membrane du TGN et la formation consécutive des GSCD. Par ailleurs, l’analyse de l’exocytose des GSCD contenant la CgA-GFP à l’aide de la microscopie à ondes évanescentes (TIRFM) ayant révélé une persistance de fluorescence à la membrane plasmique après exocytose, nous avons recherché la présence de la CgA au niveau des sites de fusion des GSCD et l’implication de l‘interaction CgA/PA dans le contrôle de l’exocytose régulée. Nous avons ainsi d’ores et déjà montré (i) que la stimulation des cellules chromaffines entraîne la présence d’une partie des molécules de CgA au niveau des sites de fusion des GSCD et (ii) que l’inhibition de la synthèse du PA produit par la PLD diminue la sécrétion régulée de CgA et des catécholamines. L’ensemble de ces données obtenues dans le cadre de ma thèse suggère que l’interaction entre la CgA et le PA a un rôle fondamental dans la dynamique des membranes au cours de la biogenèse des GSCD, et ainsi dans la sécrétion des cellules neuroendocrines.Regulated exocytosis of neuroendocrine cells is a finely controlled fundamental biological mechanism governing the release of hormones into the extracellular medium following the fusion of dense-core secretory granules (DCSG) with the plasma membrane. These organelles, generated by budding from the trans-golgian network (TGN) membrane, contain hormones and neuropeptides as well as soluble glycoproteins, granins, and are therefore essential actors of cell homeostasis. Among granins, chromogranin A (CgA) plays a major role in DCSG biogenesis, but the underlying molecular mechanisms are not clearly identified. Previously, my team demonstrated that CgA expression in non-endocrine COS7 cells (devoid of DCSG and therefore of regulated exocytosis) induces the formation of vesicles with DCSG characteristics and that the deletion of CgA -helix terminal regions significantly reduce the formation of these vesicles. Since helices ensure that proteins interact with biological membranes, we were interested in the interaction between CgA and membrane phospholipids during my thesis. We first showed that CgA interacts specifically with phosphatidic acid (PA), a conical lipid with a key role in the regulated neuroendocrine secretion. Then, using LC-MS/MS mass spectrometry, we (i) identified PA predominant forms (PA (36: 1) and (40: 6)) and observed that they are common in Golgi and granular membranes, (ii) demonstrated that CgA interacts with those PA forms inserted in artificial membrane models, leading to the deformation/remodeling of these membrane models. Furthermore, in silico analysis of the CgA sequence revealed the presence of a PA-binding domain (PABD) at the level of its C-terminal region. Then, we observed that the deletion of this region significantly alters CgA binding to PA forms previously identified, as well as the formation of DCSG within neuroendocrine cells. Finally, the genetic or pharmacological inhibition of PLD, the enzyme involved in PA synthesis within the regulated secretory pathway, results in a significant decrease of the DCSG number. This work shows for the first time the importance of CgA/PA interaction in the curvature of the TGN membrane and the resulting DCSG biogenesis. Furthermore, the analysis of the exocytosis of CgA-GFP containing DCSG using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) showing a persistent fluorescence at the plasma membrane after exocytosis, we looked for the presence of CgA at DCSG fusion sites and the involvement of CgA/PA interaction in the control of regulated exocytosis. Thus, we have already shown (i) that chromaffin cell stimulation leads to the presence of CgA molecules at the level of DCSG fusion sites and (ii) that the inhibition of PA synthesis through PLD decreases the regulated secretion of CgA and catecholamines