In vivo study, using CRISPR/Cas9, of frequent mutations found in hepatic carcinogenesis : from the Wnt/Beta-catenin pathway to ARID2 chromatin remodeler

Le carcinome hépatocellulaire est le cancer primitif du foie le plus fréquent. D’un point de vue génétique, le développement des approches génomiques a permis de montrer deux voies principales de carcinogenèse hépatique dans le CHC. Une première voie caractérisée par son instabilité génétique fait intervenir le plus souvent des mutations de TP53, un gène suppresseur de tumeur bien connu dans les cancers. Dans environ le tiers des CHC, une seconde voie implique des mutations du gène CTNNB1 codant pour la protéine ß-caténine. L’analyse des altérations génétiques récurrentes dans le CHC humain a permis de révéler que les mutations de CTNNB1 sont fréquemment associées à celles portant sur le gène ARID2, codant un composant des complexes SWI/SNF qui jouent leur rôle de remodeleurs chromatiniens en modifiant la disposition des nucléosomes, modifiant ainsi la compaction de l’ADN et régulant l’expression des gènes.Afin d’étudier dans le foie le caractère oncogénique de l’activation de la signalisation Wnt/ß-caténine, un modèle murin développé dans l’équipe utilise la stratégie Cre-LoxP pour réaliser de manière hépato-spécifique et inductible une perte-de-fonction d’Apc (ApcKO), protéine nécessaire à la dégradation de la ß-caténine. La perte-de-fonction bi-allélique d’Apc est suffisante pour : (1) induire l’activation de la signalisation Wnt/ß-caténine ; (2) induire une tumorigenèse hépatique partageant transcriptionnellement des caractéristiques communes avec les CHC humains mutés CTNNB1. Il faut savoir que les mutations d’Apc sont rares dans le CHC (1%). Il était légitime de se demander si le modèle ApcKO est pertinent, d’autant plus dans un contexte où d’autres équipes de recherche ont échoué à induire une tumorigenèse hépatique en utilisant un modèle Cre-loxP reproduisant une mutation de CTNNB1 retrouvée chez l’homme, la délétion de l’exon 3 (ßcatΔex3). Mes travaux de thèse ont eu pour objectif de répondre à deux questions : - Est-ce que le modèle murin ApcKO est équivalent au modèle ßcatΔex3 ? - Quel est l’impact de la mutation d’Arid2 dans la carcinogenèse hépatique ?J’ai pu montrer par la technologie CRISPR/cas9 peut être utilisée rapidement in vivo pour induire une carcinogenèse hépatique en mimant les modèles ApcKO et ßcatΔex3. Nous avons aussi pu montrer que la délétion de l’exon 3 de Ctnnb1 était, à elle seule, suffisante pour induire une carcinogenèse hépatique, que ce soit via CRISPR in vivo ou via la technologie Cre-loxP. Concernant le caractère oncogénique des mutation d’Arid2, les résultats préliminaires suggèrent que ces mutations ne sont pas suffisantes à l’initiation tumorale.One-third of hepatocellular carcinomas (HCCs) have mutations that activate the β-catenin pathway with mostly CTNNB1 mutations. Mouse models using Adenomatous polyposis coli (Apc) loss-of-functions (LOF) are widely used to mimic β-catenin dependent tumorigenesis. Considering the low prevalence of APC mutations in human HCCs we aimed to generate hepatic tumors through CTNNB1 exon 3 deletion (βcat∆ex3) and to compare them to hepatic tumors with Apc LOF engineered through a frameshift in exon 15 (Apcfs-ex15).I used hepatic-specific and inducible Cre-lox mouse models as well as a hepatic-specific in vivo CRISPR/Cas9 approach using AAV vectors, to generate Apcfs-ex15 and βcat∆ex3 hepatic tumors harboring activation of the β-catenin pathway. Tumors generated by the Cre-lox models were analyzed phenotypically using immunohistochemistry and were selected for transcriptomic analysis using RNA-sequencing. Mouse RNAseq data were compared to human RNAseq data (normal tissues (8), HCCs (48) and hepatoblastomas (9)) in an integrative analysis. Tumors generated via CRISPR were analyzed using DNA sequencing and immunohistochemistry.Unlike what was previously reported, mice with βcat∆ex3 alteration in hepatocytes developed liver tumors. Generated tumors were indistinguishable from those arising in Apcfs-ex15 mice. Both Apcfs-ex15 and βcat∆ex3 mouse models induced two phenotypically distinct tumors (differentiated or undifferentiated). Integrative analysis of human and mouse tumors showed that mouse differentiated tumors are close to human well differentiated CTNNB1-mutated tumors, while undifferentiated ones are closer to human mesenchymal hepatoblastomas. Apcfs-ex15 and βcat∆ex3 mouse models similarly induce tumors transcriptionally close to either well differentiated β-Catenin activated human HCCs or mesenchymal hepatoblastomas.I also used CRISPR in vivo to test the oncogenic potential of Arid2 mutations alone or in mouse models of β-catenin activated tumors. I found that Arid2 mutation in hepatocytes is not sufficient to induce tumorigenesis and tried to understand the potential oncogenic cooperation between Arid2 loss-of-function and the activation of the Wnt/β-catenin pathway