Structural characterisation of the transcription cycle of influenza polymerase

Les virus influenza sont un groupe d’agents pathogènes qui causent la grippe, une maladie infectieuse qui représente un risque majeur pour la santé des populations vulnérables. À ce jour, les stratégies de vaccination et de traitements antiviraux existants se montrent insuffisants pour adresser pleinement les enjeux de la maladie.L’enzyme clé responsable de la réplication du génome virale est l'ARN polymérase ARN-dépendante (FluPol). Lors de la transcription, les ARN messagers (ARNm) viraux qui portent une coiffe et une queue poly(A) à leurs extrémités 5’ et 3’ respectives sont synthétisés. La transcription virale commence par l'acquisition d'une amorce ARN par un mécanisme unique appelé cap snatching et est suivie de divers changements conformationnels au cours de la synthèse de l'ARNm. Jusqu'à présent, les événements dynamiques lors de la transcription, y compris le mécanisme de polyadénylation, étaient peu compris au niveau moléculaire.Pour étudier la polymérase de la grippe « en action », le projet a consisté en les étapes suivantes : (1) expression et purification des protéines ; (2) conception d’une série de mini-matrices ARN virales (mini-vRNA) qui portent les caractéristiques nécessaires telles que le signal de polyadénylation et les séquences conservées dans leur extrémités 3’ et 5’ ; (3) optimisation des conditions de transcription in vitro avec un essai qui repose sur l’incorporation de nucléotides radioactifs ; (4) séquençage ARN des produits de FluPol afin de valider l’approche employée ; (5) optimisation des échantillons, collecte et analyse des données microscopiques afin de résoudre les structures atomiques à haute résolution correspondant aux étapes successives de la transcription virale.Les travaux de thèse présentent une série de huit structures à haute résolution et décrivent au niveau moléculaire un cycle complet de transcription virale. Dans un premier temps, ce modèle détaillé montre la trajectoire de la matrice virale lors de la translocation et dévoile le rôle d’interaction de l’extrémité 3’ de la matrice avec un site secondaire sur la polymérase. Un tel site a été observé par d’autres, mais ces nouvelles structures permettent seulement maintenant de dévoiler son rôle. Ensuite, la comparaison de deux structures de terminaison sur différentes mini-matrices d'ARN, portant la séquence signal de polyadénylation native ou mutée, a permis de mieux comprendre le mécanisme de polyadénylation, unique pour cette classe de virus à ARN. Enfin, une fois le produit ARNm dissocié, la matrice d’ARN reste enfilée à l'intérieur de la polymérase et ne peut être libérée que par un changement majeur de la conformation de la FluPol. À la fin d'un cycle de transcription, les deux extrémités de la matrice virale restent liées à la FluPol dans leurs sites respectifs, ce qui assure une protection contre la dégradation et permet un recyclage efficace et le lancement du cycle de transcription suivant sans dissociation du complexe ARN-protéine.Grâce aux résultats obtenus, il a été démontré que plusieurs cycles de transcription peuvent être menés par une seule copie de l’ARN polymérase sans la dissociation de la matrice virale. Cela démontre non seulement le rôle fondamental de la polymérase grippale lors de l’infection, mais aussi souligne qu’elle est une cible importante pour le développement d’inhibiteurs viraux. Ce mécanisme semble également être conservé pour d'autres virus à ARN, des sites analogues ayant été observés dans les polymérases des bunya- et des arénavirus. D’autre part, la méthodologie développée au cours de cette thèse présente des structures à des résolutions sans précédent (allants jusqu’à 2.4 Å) qui permettent notamment de visualiser des molécules d’eau, ouvrant une voie pour la découverte d’inhibiteurs puissants de la polymérase grippale par cryo-EM.Influenza (flu) virus causes mild to severe infection of the respiratory tract, which can represent a major health risk in vulnerable populations. Currently available vaccination and antiviral treatment strategies are insufficient to fully tackle the disease burden.The key enzyme responsible for replication of the viral negative sense RNA genome (vRNA) is the virally encoded RNA-dependent RNA polymerase (FluPol). During influenza transcription, FluPol synthesizes viral mRNAs that carry a 5ʹ cap and 3ʹ poly(A) tail. Viral transcription begins with the acquisition of a capped primer by a mechanism called cap-snatching and is followed by various conformational changes during RNA synthesis. Until now, the highly dynamic events occurring during active transcription, including the mechanism of polyadenylation, were poorly understood at the molecular level.To study FluPol “in action”, the following steps were necessary: (1) protein expression and purification; (2) the design of mini-vRNA templates carrying necessary characteristics such as the polyadenylation signal and the conserved sequences at their 3′ and 5′ ends; (3) optimization of the in vitro assay based on the incorporation of radioactive nucleotides in order to stall FluPol transcription at the respective steps such as elongation or polyadenylation; (4) next-generation RNA seq. of the polymerase transcripts to validate the approach; (5) cryo EM sample preparation, data collection and analysis in order to solve the high resolution structures corresponding to the successive steps of viral transcription visualizing its dynamic nature.Resulting eight cryo EM structures provided molecular understanding of multiple key questions regarding the complete cycle of viral transcription. Firstly, the viral template trajectory during translocation was visualised and it now became apparent how the FluPol undergoes conformational changes in order to guide the outgoing viral template after it has been transcribed. The 3ʹ extremity of the template then docks in the recently identified novel RNA binding pocket on the polymerase surface and only now the functional role of this secondary RNA binding site was elucidated. Moreover, the comparison of two termination structures on different mini-vRNA templates, carrying native or mutated polyadenylation signal sequence, provided insight into the polyadenylation mechanism which is unique for this class of RNA viruses. Finally, after the mRNA product has been released, the vRNA template remains threaded through the polymerase interior and can be released only by a major conformation change of the protein structure. At the end of one transcription cycle, both extremities of the viral template remain bound to the FluPol in their respective sites, providing protection from degradation as well as allowing efficient recycling and initiation of the next round of transcription without the RNA-protein complex dissociation.These results let us describe the entire transcription cycle by FluPol, provide a strong rationale for a previously unknown role of the secondary 3ʹ end binding site, gain insight into a unique mechanism of polyadenylation at the molecular level and propose a mechanism of polymerase recycling. Proposed mechanism explains how the influenza virus can efficiently carry multiple rounds of transcription without protein-template complex dissociation. This is especially important early in infection, where efficient synthesis of viral mRNA has to be ensured to allow subsequent synthesis of viral proteins. This mechanism seems to be conserved also for other RNA viruses as an analogous 3ʹ end binding sites were observed in bunya and arenavirus polymerases. Moreover, the methodology developed during my thesis allows FluPol structures to be determined at unprecedented resolution (up to 2.4 Å) visualizing water molecules. This opens a path for the discovery of powerful inhibitors, such as nucleoside analogues, by means of cryo-EM