Avaliação de práticas sanitárias e detecção de mutações no gene da beta-tubulina em populações de Haemonchus contortus coletados no oeste do Paraná, Brasil

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Beltrão MolentoCoorientador: Prof. Dr. Jomar Patrício MonteiroDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de CIências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 30/03/2021Inclui referênciasResumo: A criação de pequenos ruminantes, possui grande importância econômica e social no mundo todo. Dentre os fatores que mais geram impactos negativos na saúde e no bem-estar desses animais, as infecções por helmintos gastrintestinais são uma das mais importantes e o agente Haemonchus contortus é o nematoda mais patogênico. H. contortus é um parasito hematófago capaz de provocar, em casos severos, a morte do hospedeiro. Em consequência disto, o controle desse helminto é baseado em anos de uso indiscriminado de anti-helmínticos, o que promoveu a seleção de parasitos resistentes. Por serem os mais antigos e mais amplamente utilizados, os benzimidazóis (BZ) são a classe de anti-helmínticos mais associada com a resistência e a mais profundamente estudada. A resistência aos BZ está associada a três polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs, single nucleotide polymorphisms): F200Y, F167Y e E198A, no isotipo 1 do gene da beta-tubulina. Métodos moleculares baseados na reação em cadeia pela polimerase (PCR, polimerase chain reaction) permitem detetar com alta sensibilidade esses SNPs. O objetivo desse estudo foi determinar a frequência de SNPs associados aos BZ em H. contortus isolados de 545 ovinos e 124 caprinos de 18 propriedades na região Oeste do Paraná. Foram identificadas práticas de manejo, que podem ser fatores de risco para o desenvolvimento da resistência nessa região. Amostras de fezes foram coletadas de animais em oito municípios: Foz do Iguaçu; Matelândia; Medianeira; Ramilândia; Santa Terezinha de Itaipu; São Miguel do Iguaçu; Serranópolis do Iguaçu e Vera Cruz do Oeste. As propriedades foram georreferenciadas e os criadores responderam a um questionário sanitário. Foram feitas coproculturas por propriedade e as larvas de terceiro estágio (L3) foram identificadas e quantificadas. O DNA genômico foi obtido de amostras com 20.000 L3 por propriedade e utilizado em ensaios de qPCR com iniciadores específicos para as mutações F200Y, F167Y e E198A de H. contortus para determinar as frequências de alelos sensíveis e resistentes de cada SNP. Foi feita análise de correlação entre as práticas sanitárias e os dados de qPCR por meio do teste ANOVA. Haemonchus spp. foi o parasito mais predominante em 67% das propriedades. Foram detectadas frequências de alelos resistentes de até 72.0% para F200Y e de 23.8% para F167Y. Apenas alelos sensíveis foram detectados para E198A. Práticas de manejo associadas a alta frequência de resistência foram encontradas nesse estudo: alta frequência de tratamentos (média de 6x/ano; 15/18), cálculo de dose por estimativa visual de peso (15/18), ausência de consórcio com outros herbívoros (14/18), tratamento de todos os animais do rebanho (14/18), ausência de quarentena (10/18) e baixa adesão do método FAMACHA de avaliação seletiva (4/18). Esse é o primeiro estudo sobre práticas de manejo e detecção molecular da resistência para o BZ, em ovinos e caprinos no Paraná. Conclui-se que os SNPs F200Y e F167Y estão presentes em populações de H. contortus do oeste paranaense e várias práticas de manejo presentes nesses locais podem favorecer o desenvolvimento de resistência.Abstract: Small ruminant farming has an important economic and social significance worldwide. Among the factors that can generate negative impacts on the health and welfare of these animals, infections by gastrointestinal helminths may be one of the most important and the agent Haemonchus contortus is the most pathogenic nematode. H. contortus is a hematophagous parasite capable of causing death in severe cases. The control of this helminth based on years of indiscriminate use of commercial anthelmintics has led to parasite selection for resistance. Because they are the oldest and most widely used, benzimidazoles (BZ) is one of the classes of anthelmintics most associated with this problem. Resistance to this class is associated with three single nucleotide polymorphisms (SNPs): F200Y, F167Y and E198A, in the isotype 1 of the beta-tubulin gene. Molecular methods based on polymerase chain reaction (PCR) allow the detection of these SNPs. The aim of this study was to determine the frequency of SNPs associated with BZ resistance in H. contortus isolated from 545 sheep and 124 goats from 18 farms in Western Paraná. Management practices that may be risk factors for the development of resistance in this region were identified. Fecal samples were collected from all animals, from properties distributed in eight municipalities: Foz do Iguaçu; Matelândia; Medianeira; Ramilândia; Santa Terezinha de Itaipu; São Miguel do Iguaçu; Serranópolis do Iguaçu and Vera Cruz do Oeste. The properties were georeferenced and the farmers answered a herd-health questionnaire. For each property, third stage larvae (L3) were obtained by fecal cultures and these larvae were identified and quantified using an optical microscope. Genomic DNA was obtained from 20.000 L3 and used in qPCR assays with specific primers for the mutations F200Y, F167Y and E198A of H. contortus to determine the frequencies of sensitive and resistant alleles of each SNP. Correlation analysis between health practices and qPCR data were performed using the ANOVA test. Haemonchus spp. was the most prevalent parasite in approximately 67% of the properties. Resistant allele frequencies of up to 72.0% were detected for the F200Y and 23.8% for the F167Y. Only sensitive alleles were detected for E198A. Management practices associated with anthelmintic resistance were found in this study: high frequency of treatments (average of 6x/year; 15/18), dose calculation by visual weight estimate (15/18), the absence of intercropping with other herbivores (14/18), treatment of all animals in the herd (14/18), absence of quarantine (10/18) and low adhesion of the FAMACHA method of selective evaluation (4/18). This is the first study on management practices and molecular detection of BZ resistance in sheep and goats in Paraná. It is concluded that the SNPs F200Y and F167Y are present in populations of H. contortus from Western Paraná and several management practices present in these farms can favor the development of resistance