Resolving Dopamine Secretion at Individual Varicosities using Carbon Nanotube-Based Optical Dopamine Nanosensors

Dopamin (DA) ist ein essentieller Botenstoff im Zentralen Nervensystem, der wichtige Funktionen des Gehirns reguliert und bei neurologischen Krankheiten eine zentrale Rolle spielt. Dennoch sind die molekularen Mechanismen der DA Sekretion kaum untersucht. Dopaminerge Transmission unterscheidet sich wesentlich von anderen, gründlich erforschten Neurotransmittern wie Glutamat. Die Strukturen, aus denen DA freigesetzt wird (Varikositäten), sind strukturell und funktionell sehr divers, jedoch konnte die molekulare Basis dieser Diversität bis heute nicht ausreichend untersucht werden. Der Grund hierfür sind hauptsächlich fehlende Methoden, welche die Freisetzung von DA auf Ebene einzelner Varikositäten räumlich auflösen können. Ich überwinde diese kritische Limitation durch Anwendung von kleinen (0,7 nm x 200 nm) Nanosensoren, die aus Kohlenstoff-Nanoröhren hergestellt werden und schon nanomolare DA Konzentrationen spezifisch und reversibel durch einen Anstieg ihrer Nahinfrarot Emission detektieren (> 900 nm). In dieser Arbeit präsentiere ich eine neue experimentelle Strategie zur Anwendung dieser Nanosensoren auf ausdifferenzierten, primären dopaminergen Neuronen, die DA Freisetzung mit hoher raumzeitlicher Auflösung (15 Bilder/s) abbilden kann: „Adsorbed Nanosensors Detecting Release of Dopamine“ (AndromeDA). AndromeDA kombiniert eine neurartige, Glia-freie dopaminerge Zellkultur mit einer homogenen Schicht aus Nanosensoren. Der maßgeschneiderte optische Weg des Mikroskopie-Aufbaus erlaubte es, nicht nur das Nahinfrarot Signal der Sensoren, sondern auch parallel dazu dopaminerge EGFP exprimierende Axone abzubilden. AndromeDA erlaubt die zeitgleiche Aufzeichnung von exozytotischen Ereignissen aus bis zu 100 Varikositäten und identifiziert lokale „Hotspots“ der DA Freisetzung. Somit ermöglicht AndromeDA die räumliche Korrelation von DA Freisetzung mit sub-zellulären Strukturen. Nach ausführlicher Validierung dieser neuen Methodik zeige ich, dass die Freisetzung von DA an diskreten Varikositäten stark variiert und dass DA von nur ~17% aller Varikositäten abgesondert wird. Darüberhinaus beobachte ich DA Exozytose, die nicht extern induziert ist und demonstriere, dass diese Eregnisse ebenfalls aus neuronaler Aktivität resultieren. Schließlich undersuche ich die Rolle und Expression von Mammalian uncoordinated 13 (Munc13) priming Proteinen in dopaminergen Neuronen und lege dar, dass nur die Munc13-1 Isoform in dopaminergen aktiven Zonen durch cytochemische Analysen vorgefunden werden kann, und dass die genetische Entfernung von Munc13-1 und Munc13-2 die elektisch-induzierte (jedoch nicht über Kalium induzierte) Ausschüttung von DA unterbindet. Somit demonstriere ich, dass Munc13 Proteine für Aktions Potential-vermittelte DA Sekretion benötigt werden. AndromeDA ist eine funktionale hochauflösende bildgebende Methode, die neue Einblicke in den DA Sekretions-Apparat ermöglicht.Dopamine (DA) is a neurotransmitter that controls vital brain functions such as motor control and motivation, but little is known about the molecular mechanisms that control DA release. Neurotransmission through DA differs substantially from well characterized neurotransmitters, such as glutamate. Dopaminergic secretion sites (varicosities) are functionally and structurally highly diverse, but the molecular basis for this diversity could not be examined to date due to the inability of existing methods to resolve DA secretion at individual release sites, especially across large varicosity populations. I circumvent this critical limitation using a layer comprised of individual small (0.7 nm x 200 nm) carbon nanotube-based nanosensors, that report local, nanomolar DA concentrations through reversible fluorescence increase (> 900 nm). I present an experimental strategy for the use of these sensors for the detection of DA secretion from long-term differentiated, primary dopaminergic cultures with high spatiotemporal resolution: “Adsorbed Nanosensors Detecting Release of Dopamine” (AndromeDA). AndromeDA combines a novel low-density, glia-free ventral midbrain neuron co-culture with a high-density nanosensor layer. At the same time, AndromeDA allows the identification of EGFP-labeled dopaminergic axons during live-cell imaging through a custom-built dual camera set up. Through imaging of millions of nanosensors in parallel, AndromeDA detects local DA secretion events from up to 100 varicosities simultaneously (hotspots), as well as DA diffusion through the extracellular space. AndromeDA facilitates, for the first time, the correlation of subcellular structures with local DA secretion events using a direct DA detection method, and allows the comparison of single release events across large varicosity populations with a temporal resolution similar to existing methods (15 data points/s). I validate that AndromeDA hotspots are representative of bona fide DA secretion events through spatio-temporal analysis and pharmacological tools. Using this new methodology, I confirm the previous proposition that action potential-evoked DA release is highly heterogeneous across individual release sites and occurs only at a subpopulation (~17%) of all varicosities. In addition, I show that AndromeDA can detect DA release mediated by spontaneous DAergic neuron activity, as well as rapid electrically evoked action potentials. Finally, I investigate the expression and functional role of Mammalian uncoordinated 13 (Munc13) priming proteins in dopaminergic neurons. I find, that only Munc13-1 is detectable by immunocytochemistry in dopaminergic active zones, and that deletion of Munc13-1 and -2 abolishes electrically evoked (but not KCl evoked) DA release, demonstrating that vesicle priming by Munc13 proteins is required for action potential mediated DA secretion. Imaging with AndromeDA is versatile and readily applicable to other in vitro systems, with an unprecedented ability to spatially correlate DA secretion events to presynaptic structures, which will enable a detailed dissection of the molecular mechanisms that give rise to the heterogeneity of the DA system.2022-07-0