Characterization of the proteomic content and immunomodulatory properties of the extracellular vesicles derived from the probiotic Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA129

Extracellular vesicles (EVs) are ubiquitous mediators of the intercellular communication and consist in an export system involved in essential processes of life, such as nutrition, adaptation, defense and host-microbe interaction. EVs are spherical non-replicating nanoparticles composed of a lipid bilayer and an internal aqueous lumen that shelters a diverse set of molecules, including proteins, nucleic acids, lipids, glycans and other metabolites. The research on bacteria-derived EVs focused initially in Gramnegative and pathogenic bacteria, but the scenario changed in the last years, including EVs derived from other groups, such as Gram-positive and non-pathogenic bacteria. A relevant Gram-positive and probiotic bacterium is Propionibacterium freudenreichii, which has been long and safely used in the production of Swiss-type cheese, organic acids and vitamin B12. P. freudenreichii has emerged in the probiotics landscape due to notable properties, such as anti-pathogenic and anti-cancer activities, modulation of the microbiota composition and immunomodulation. Some of these properties were attributed to surface-exposed or secreted factors. Therefore, we aimed to investigate whether P. freudenreichii produced EVs that could mediate its beneficial properties, particularly immunomodulation. Accordingly, the bacterium was cultured in milk ultrafiltrate (UF) or yeast extract-lactate (YEL) medium until the beginning of the stationary phase. Protocols for EV purification based on size-exclusion chromatography (SEC) or density gradient ultracentrifugation (UC) were applied. The resulting samples presented nano-sized particles with typical morphology, confirming EV production by P. freudenreichii. EV protein content was investigated with shotgun proteomics approaches, unveiling a diverse set of proteins that included immunomodulatory and cytoplasmic proteins. The protein cargo and interactomics analysis indicated potential immunomodulatory roles for P. freudenreichii-derived EVs. That was confirmed with the EV-mediated reduction of IL-8 release and NF-κB activity in human intestinal epithelial cells treated with bacterial LPS, indicating an anti-inflammatory role. Moreover, EVs properties were dependent on the culture medium used to grow bacteria, since they varied for EVs derived from UF or YEL, including EV size, abundance, protein content and anti-inflammatory activity. Furthermore, the method used for EV purification also impacted EVs properties, particularly protein content. Although there were exclusive proteins for some conditions, hundreds of proteins were identified in all the studied conditions, indicating the existence of a conserved core proteome. Altogether, these findings contribute to the understanding of the mechanisms underlying the probiotic effect in P. freudenreichii and reveal novel possibilities for the developing of optimizable and safe nanotechnological delivery systems, potentially holding a great impact in human health.Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des médiateurs ubiquitaires de la communication intercellulaire et consistent en un système d'exportation impliqué dans des processus essentiels de la vie, tels que la nutrition, l'adaptation, la défense et l'interaction hôte-microbe. Les VEs sont des nanoparticules sphériques non réplicatives composées d'une bicouche lipidique et d'une lumière aqueuse interne qui abrite un ensemble diversifié de molécules, notamment des protéines, des acides nucléiques, des lipides, des glycanes et d'autres métabolites. La recherche sur les VEs dérivés de bactéries s'est concentrée initialement sur les bactéries Gram-négatives et pathogènes, mais le scénario a changé au cours des dernières années, intégrant les VEs dérivés d'autres groupes, comme les bactéries Gram-positives et non pathogènes. Une bactérie Gram-positive et probiotique pertinente est Propionibacterium freudenreichii, qui est utilisée depuis longtemps et en toute sécurité dans la production de fromage de type suisse, d'acides organiques et de vitamine B12. P. freudenreichii a émergé dans le panorama des probiotiques en raison de propriétés notables, telles que les activités antipathogènes et anticancéreuses, la modulation de la composition du microbiote et l'immunomodulation. Certaines de ces propriétés ont été attribuées à des facteurs exposés à la surface ou sécrétés. Par conséquent, nous avons cherché à déterminer si P. freudenreichii produisait des VEs qui pourraient médier ses propriétés bénéfiques, en particulier l'immunomodulation. En conséquence, la bactérie a été cultivée en milieu ultrafiltrat de lait (UF) ou extrait de levure-lactate (YEL) jusqu'au début de la phase stationnaire. Des protocoles de purification de VEs basés sur la chromatographie d'exclusion de taille (SEC) ou l'ultracentrifugation (UC) à gradient de densité ont été appliqués. Les échantillons résultants présentaient des particules de taille nanométrique avec une morphologie typique, confirmant la production de VEs par P. freudenreichii. Lecontenu en protéines de VEs a été étudiée avec des approches de protéomiques shotgun, dévoilant un ensemble diversifié comprenant des protéines immunomodulatrices et cytoplasmiques. L'analyse du contenu protéique et d'interactomique ont indiqué des rôles immunomodulateurs potentiels pour les VEs dérivés de P. freudenreichii. Cela a été confirmé par la réduction médiée par les VEs de la libération d'IL-8 et de l'activité de NF-kB dans les cellules épithéliales intestinales humaines traitées avec du LPS bactérien, indiquant un rôle anti-inflammatoire. De plus, les propriétés des VEs dépendaient du milieu de culture utilisé pour cultiver les bactéries, car elles variaient pour les VEs dérivés de l'UF ou du YEL, y compris la taille, l'abondance, le contenu en protéines et l'activité anti-inflammatoire des VEs. En outre, la méthode utilisée pour la purification des VEs a également eu un impact sur les propriétés des VEs, en particulier le contenu en protéines. Bien qu'il y ait eu des protéines exclusives pour certaines conditions, des centaines de protéines ont été identifiées dans toutes les conditions étudiées, indiquant l'existence d'un protéome vii central conservé. Dans l'ensemble, ces résultats contribuent à la compréhension des mécanismes sous-jacents à l'effet probiotique chez P. freudenreichii et révèlent de nouvelles possibilités pour le développement de systèmes nanotechnologiques de livraison optimisables et sûrs, susceptibles d'avoir un grand impact sur la santé humaine