Challenge of genetically modified sweet orange plants to infection by Candidatus Liberibacter asiaticus and Xanthomonas citri subsp. citri

O Brasil é o maior produtor mundial de laranja doce, assim como o maior exportador de suco concentrado. Entretanto, o setor citrícola apresenta algumas dificuldades no processo produtivo atribuídas, principalmente, a problemas fitossanitários, com ênfase para doenças bacterianas, a exemplo do huanglongbing (HLB) e do cancro cítrico. O HLB é considerado uma das doenças mais destrutivas que a citricultura já enfrentou, sendo agravada pela ausência de medidas curativas e de cultivares de citros resistentes. Da mesma forma, o cancro cítrico é uma importante doença, a qual tem registrado um aumento considerável de sua incidência nos pomares cítricos nos anos recentes. Nesse cenário, a produção de plantas transgênicas pode ser uma solução eficaz na busca de cultivares resistentes com o uso de diversas estratégias, tais como a expressão de genes que codificam peptídeos antimicrobianos e de genes diferencialmente expressos em plantas resistentes inoculadas com diferentes patógenos. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a reação de plantas de laranja \'Hamlin\' (Citrus sinensis L. Osbeck) transformadas com o gene que codifica o peptídeo antimicrobiano e sintético d4el, dirigido pelo promotor 35S e plantas de laranja \'Hamlin\' transformadas com o gene que codifica a superóxido dismutase do cobre e do zinco (csdl), isolado de Poncirus trifoliata e dirigido pelo promotor Ubiquitina 10, desafiando-as contra Candidatus Liberibacter asiaticus e Xanthomonas citri subsp. citri. As plantas de laranja \'Hamlin\' foram propagadas, por enxertia, em porta-enxertos de limão \'Cravo\' (Citrus limonia Osbeck), e então inoculadas com borbulhões infectados com CLas, ou inoculadas, por aspersão e por ferimentos, com suspensão de Xcc. A presença e concentração de CLas foram determinadas nos tecidos foliares, por qPCR, seis, 12 e 18 meses após a inoculação (m.a.i.). O acúmulo de peróxido de hidrogênio, as atividades de enzimas antioxidantes e a detecção de calose foram avaliadas em eventos transgênicos de laranjeira doce após as inoculações dos patógenos. Cinco eventos transgênicos que expressam o gene csdl e outro, expressando o gene d4el, exibiram populações reduzidas de CLas quando comparados com plantas não transgênicas, e não mostraram sintomas visíveis de HLB, seis m.a.i. de CLas. A incidência e severidade de cancro cítrico foram reduzidas em alguns eventos transgênicos, exibindo populações de Xcc significativamente inferiores quando comparadas com plantas não transgênicas. Os eventos transgênicos que registraram maiores atividades isoenzimáticas de SOD também exibiram maiores acúmulos de peróxido de hidrogênio nos tecidos foliares, após a inoculação com Xcc. A análise de epifluorescência mostrou alta deposição de calose nos elementos de tubo crivado nos tecidos foliares de alguns eventos transgênicos. Esses resultados sugerem que a formação da calose pode ser uma importante resposta de defesa aos estresses bióticos, resultando em menores populações de CLas e Xcc.Brazil is the world\'s largest producer of sweet orange, as well as the largest exporter of concentrated juice. However, the citrus sector has some difficulties in the production process, mainly attributed to phytosanitary problems, with emphasis on bacterial diseases, such as huanglongbing (HLB) and citrus canker. HLB is of the most destructive diseases that the citrus industry has ever faced, being aggravated by the absence of curative measures and resistant citrus cultivars. Likewise, citrus canker is an important disease, which has registered a considerable increase in its incidence in citrus groves in the recent years. In this scenario, the production of transgenic plants can be an effective solution in the search for resistant cultivars with the use of several strategies, such as the expression of genes that encode antimicrobial peptides and of genes differentially expressed in resistant plants inoculated with different pathogens. Therefore, the objective of this work was to evaluate the reaction of \'Hamlin\' sweet orange plants (Citrus sinensis L. Osbeck) transformed with the gene that encodes the d4e1 antimicrobial and synthetic peptide, directed by the 35S promoter and \'Hamlin\' sweet orange plants transformed with the gene expressing a copper and zinc superoxide dismutase (csdl), isolated from Poncirus trifoliata and directed by Ubiquitin 10 promoter, challenging them against Candidatus Liberibacter asiaticus and Xanthomonas citri subsp. citri. The \'Hamlin\' sweet orange plants were propagated by grafting on Rangpur lime rootstocks (Citrus limonia Osbeck), and then graft-inoculated with CLas contaminated axillary buds, or inoculated, by spraying and wounding, with a Xcc suspension. The presence and concentration of CLas were determined in the leaf tissues, by qPCR, six, 12, and 18 months after inoculation (m.a.i.). The hydrogen peroxide accumulation, activities of antioxidant enzymes, and detection of callose were evaluated in transgenic sweet orange events after the inoculation of the pathogens. Five transgenic events expressing csdl and another, expressing d4el gene, exhibited reduced Clas populations when compared with non-transgenic plants, and showed no visible HLB symptoms six m.a.i.. The incidence and severity of citrus canker have been reduced in some transgenic events, showing significantly lower Xcc populations when compared to non-transgenic plants. The transgenic events that registered greater SOD isoenzymatic activities also exhibited greater hydrogen peroxide accumulations in the leaf tissues, after Xcc inoculation. Epifluorescence analysis showed a high amount of callose deposition in the sieved tube elements of the leaf tissues in some of the transgenic lines. These results suggest that the formation of callose may be an important defense response these biotic stresses, resulting in lower CLas and Xcc population