Identification of RHD and RHCE gene variants in patients with sickle cell anemia using a new generation sequencing strategy

Introdução: Os antígenos eritrocitários do sistema de grupo sanguíneo RH são codificados por dois genes altamente homólogos, RHD e RHCE, sendo que os rearranjos gênicos são responsáveis pelas variantes de antígenos por eles codificados. A complexidade dessa variação genética, principalmente em pacientes em regime crônico de transfusão, como aqueles com a doença falciforme (DF), contribui para elevada taxa de aloimunização eritrocitária. Os ensaios moleculares convencionais não conseguem identificar todas as variantes genéticas já descritas para o locus RH, bem como prever novos alelos. O sequenciamento de RHD e RHCE é indicado para ampliar a pesquisa de variantes genéticas de Rh. OBJETIVOS: 1) Padronizar a estratégia de sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing - NGS) para identificar assertivamente variantes genéticas de Rh entre pacientes com DF com suspeita sorológica de variantes de Rh. 2) Correlacionar dados genéticos com a classificação sorológica dos anticorpos RH não esperados (direcionados contra antígenos para os quais a fenotipagem eritrocitária é positiva). MÉTODOS: Trinta e cinco pacientes com DF com anticorpos RH não esperados foram incluídos. Estratégia de NGS foi desenvolvida para genotipar RHD e RHCE usando primers gene-específicos. Os dados genotípicos e sorológicos foram comparados. RESULTADOS: Os dados obtidos no ensaio de NGS foram específicos para os genes RHD e RHCE. Dez e vinte e cinco alelos variantes de RHD e RHCE foram identificados, respectivamente. Entre todos os casos de anticorpos RH não esperados, 62% foram classificados de maneira imprecisa por análise sorológica e, dentre esses casos, 73,1% foram considerados como potencialmente prejudiciais ao paciente, visto que a classificação inacurada do anticorpo como auto ou alo poderia se associar a aumento do risco de reações hemolíticas pós-transfusionais ou falta de unidades de tipo O RhD negativo para transfusão. Encontrados dois novos alelos não descritos na literatura, ainda necessitando de ensaios sorológicos no intuito de determinar se esses codificam antígenos parciais. CONCLUSÃO: O ensaio NGS projetado para genotipar regiões codificadoras de RH foi eficaz e preciso na identificação de variantes. A estratégia proposta esclareceu o fenótipo Rh da maioria dos pacientes, melhorando o suporte à transfusão.Introduction: The erythrocyte antigens of the Rh blood group system are encoded by two highly homologous genes, RHD and RHCE, and gene rearrangements are responsible for variants of these antigens. The complexity of this genetic variation, especially in patients with chronic transfusion, such as sickle cell disease (SCD), has a high rate of alloimmunization. Conventional molecular assays cannot identify all genetic variants already described for the RH locus as well as predict new alleles. RHD and RHCE sequencing is indicated to broaden the search for Rh genetic variants. AIMS:1) To standardize the Next Generation Sequencing (NGS) strategy to assertively identify Rh genetic variants among SCD patients with serologic suspicion of Rh variants and evaluate if it can improve the transfusion support.2) To correlate genotype with phenotype data in the case of unexplained Rh antibodies (directed to antigens with positive phenotype). METHODS: Thirty-five SCD patients with unexplained Rh antibodies were enrolled. A NGS-based strategy was developed to genotype RHD and RHCE using gene-specific primers. Genotype and serological data were compared. RESULTS: Data obtained from the NGS-based assay were gene-specific. Ten and 25 variant RHD and RHCE alleles were identified, respectively. Among all cases of unexplained Rh antibodies, 62% had been inaccurately classified by serological analysis and, of these, 73.1% were considered as relevant, as were associated with increased risk of hemolytic reactions and shortage of units suitable for transfusion. Found two new alleles not described in the literature, still needing serological tests in order to determine whether they encode partial antigens. CONCLUSION: The NGS assay designed to genotype RH coding regions was effective and accurate in identifying variants. The proposed strategy clarified the Rh phenotype of most patients, improving transfusion support